分离ARVM细胞

步骤

一、ARVM 细胞分离的准备工作

1. 准备如下设备及器材：

对流工作台或层流式超净台

乙酉迷罩 

冷凝器

循环水浴和水浴摇床

带夹的圈型架

免蠕动泵

台式医用离心机

95% O2 5% CO2 混合气体

400 ml 无菌烧杯

ColorpHast pH 试纸（精密型）

2. 在对流式或层流式工作台中，装配 Langedorff 系统，把冷凝器和三通管夹着固定在圈型架上，管子接上蠕动泵。冷凝器连接 37℃ 循环水浴，这样温水从冷凝器底部流进从顶部流回水浴。

3. 在工作台的无菌区域，布置下列无菌器械，这些可以是高压灭菌过的或一次性无菌器材：

组织钳

大号剪刀

弯头小夹子 2 个

小剪刀

蚊式止血钳

Swinnex 25 mm 规格的滤器支架

250 ml 烧杯

玻璃管和硅胶管

带螺盖的，50 ml 锥形瓶，内加小搅拌棒

带螺盖的 250 ml 锥形瓶

一次性培养皿，吸管，60 ml 注射器，15 ml 和 50 ml 离心管，缝合线

4. 准备加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit（KH）培养基，过滤除菌 37℃ 保温。

5. 充氧饱和 KH 缓冲液和无钙 KH 培养基直到 pH 值约 7.4。转移 150 ml 氧饱和的无钙 KH 缓冲液至无菌的 250 ml 带螺帽锥形瓶中并置于 37℃ 水浴。螺帽务必盖好。

6. 制备酶溶液Ⅰ。装有氧饱和的无钙 KH 缓冲液的锥形瓶中加 75 mg 的胶原酶和 45 mg 的透明质酸酶。

7. 制备酶溶液Ⅱ。取 21 ml 溶液Ⅰ转移至一支新管中，加 2 ml 胰酶和 20 μl 无菌 1 mol/L CaCl2 过滤除菌。胶原酶/透明质酸酶溶液移至一无菌的 250 ml 的带螺帽锥形瓶中，胶原酶/透明质酸酶/胰酶液移至一无菌的 50 ml 带螺帽锥形瓶中。

8. 往第一个 250 ml 烧杯中加 150 ml KH 缓冲液，并加入灌注系统，避免产生气泡。在插管处检查流过液的 pH 值，通以 95% O2/5%CO2 气体将 pH 值调回 7.4。流出液体回收到无菌 400 ml 烧杯中。

9. 用预温的 KH 缓冲液覆盖整个平皿底。

10. 把第一只鼠放进乙酉迷罩 中麻醉。

11. 把充过氧的无钙 KH 缓冲液放进第二只 250 ml 无菌烧杯中，将流速调高至 5.5 ml/min，灌注 6 分钟。

12. 酶溶液Ⅰ放进第三只 250 ml 烧杯中，泵速度调节至 8 ml/min，灌注 5 分钟。把该 250 ml 烧杯放在心脏下面继续重新灌注心脏 15 分钟以上。

二、解剖动物和灌注心脏

1. 动物被麻醉后，放在 Langendorff 装置的附近。动物平躺放置，用乙醇浸润胸部剪开胸部皮毛。

2. 用大剪刀在肋骨下切一横向切口打开胸腔，然后切开胸膈膜。

3. 提起剑突，胸中线两边约 2 cm 处沿肋骨各做一条径向切口，千万不要触及心脏。

4. 用夹子掂起心脏，剪断下方的连接，摘下心脏和胸腺，摘下的心脏放在装有 KH 溶液的佩特里氏平皿，然后转到支着灌注设备的工作台上。

5. 把心脏移到平皿的边缘，提起胸腺露出主动脉，用小剪刀剪掉胸腺。

6. 打开泵，流速调至约每秒一滴。双手稳握两把小钳子，使主动脉沿插套滑动至插套管底部位于心脏的顶部。

7. 用蚊式止血钳固定住心脏，钳子夹着主动脉底部并保证止血钳夹着主动脉上端。

8. 在止血钳下部，用缝合线牢固地绑住心脏，灌注 3~5 分钟使心脏血全部排出。

9. 从心脏上剔除残余组织，保持肺动脉以及动脉附属件的完整性。

三、心脏组织的消化

1. 酶溶液Ⅰ进行灌注的最后 2 分钟时，用 colorp Hast 试纸检查液体的 pH 值，若有必要，通气调节 pH 至 7.4。

2. 从插套管上割下心室并仔细切成 1 mm2 的小块。转入装有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 锥形瓶中，于 37℃ 水浴，100 r/min 摇动孵育 15 分钟。

3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述样品后转入一支 50 ml 锥形离心管中加 20 ml 洗涤培养基。

4. 一支 60 ml 注射器，拿掉推杆，装上 Swinnex 滤器。往针筒内加入细胞悬液，把细胞过滤到一支新管中。

5. 500 r/min（50 g）离心 30 秒，去上清后，细胞重新溶于 10 ml 新的洗涤培养基中。

6. 让梭形细胞沉降 20 分钟，小心去上清，用 10 ml 新洗涤培养基重悬细胞。

7. 让细胞沉降 15 分钟，去上清，用 10 ml 洗涤培养基重悬细胞。

8. 重复上述洗涤步骤，共洗 4 次，最后一次洗涤后，倒去上清。加入 5 ml 洗涤培养基。

9. 重悬细胞后小心铺放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上层，让梭形细胞沉降 10~15 分钟。

10. 最后的细胞团应包含高比例的活的梭形心室心脏细胞。每只心脏若能收到 3X106 个细胞就很不错了。

四、ARVM 细胞的培养

1. 在上述细胞洗涤的同时，准备包被平板/盖玻片/载玻片于室温，用 10 μg/ml 层黏素溶液浸没 30 分钟。

2. 加入适量的培养皿重悬最后所得的细胞团，并以每只 100 mm 规格平皿 1X106 个细胞的量接种至已包被过的平板上。

3. 让细胞贴壁 1 小时，然后换新的培养基连续孵育。用加血清或不加血清的培养基继续培养 1 或 2 周。

4. 细胞隔天换液。

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