非肌肉肌动蛋白的纯化

步骤

1. 准备贮存液和材料。

2x DNA 酶Ⅰ缓冲液：

20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

1 mmol/L DTT

0.4 mmol/L CaCI2

0.4 mmol/L ATP

抑蛋白酶肽

抑蛋白酶

亮抑蛋白酶肽

抑胃酶肽 A

PMSF

TPCK

50% 甲醛在 DNA 酶柱缓冲液中

0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中

0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中

DNA酶Ⅰ柱缓冲液

2. 准备一个 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的亲和柱。

3. 准备一个 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱：用 DNA 酶Ⅰ缓冲液平衡的 DEAE-纤维素。

4. 通过离心收集细胞并用等渗盐溶液（例如 PBS ) 洗去培养液。

5. 在加蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液中重悬细胞沉淀物。

6. 用对于感兴趣细胞的标准方法进行细胞匀浆。

7. 用相差显微镜证实超过 99% 的细胞已经裂解了。

8. 100000 g 离心裂解物 45 分钟。

9. 用巴斯德吸管转移上清，避免混入脂肪。

10. 柱子上样：

(1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ缓冲液加蛋白酶抑制剂平衡了的 DNA 酶Ⅰ亲和介质混合，并把介质/蛋白混合物倒到一个小杆子中。

(2) 在装填柱子时收集流出液，通过用抗肌动蛋白抗体进行的免疫印迹、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 来证实有大量肌动蛋白留在柱子中。

11. 用 2 倍体积含蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制剂和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子。

12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱肌动蛋白。

13. 立即把 50% 甲醛洗脱液上样到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。

14. 用 5 倍体积的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗 DEAE 柱，然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱。分部收集，每管 200 μl。

15. 检测收集液的蛋白浓度，然后混合出峰时的收集液。

16. 加 MgCl2 使浓度为 2 mmol/L ( 这是选用于天然肌动蛋白），以使肌动蛋白聚合，用 SDS-PAGE 分析多肽组成。

产量应该是 5% 左右，所以从湿重 10 g 的细胞指望得到 2.5~5 mg 纯化了的肌动蛋白是合理的。