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放射自显影术实验
发布时间： 2022-12-06 点击次数： 1016次简介
培养细胞的放射自显影术射性既可以研究细胞本身的物质代谢之外，还可用来分析细胞的动态活动、细胞周期等。
原理
培养细胞放射自显影术原理是将培养细胞的放射性同位素释放射线，作用于感光乳胶，使感光乳胶中的卤化银感光形成潜影，再经显影剂作用，感光的卤化银还原成黑色的银颗粒，未感光的银盐则经定影去除，在乳胶中留下清楚明确的图像。
材料与仪器
器材：① 培养的细胞② 细胞传代培养的设备③ 直径 3.5 cm 塑料培养皿（或 50 ml 培养瓶）④ 2.2 cm x 2.2 cm 盖片（或自裁成 6 mm x 40 mm，放入培养瓶）⑤ 曝光铅盒或黑色塑料盒⑥ 电磁搅拌器⑦ 恒温台（可调节温度以烘干乳胶）⑧ 载片⑨ 中性树胶⑩ 暗室及相应设备试剂：① 同位素标记物（如 3 H-TdR、3 H-UdR 等）② 液体乳胶（常用核 IN 号）③ 显影液④ 定影液⑤ 甲醇⑥ 吉姆萨染液步骤
培养细胞放射自显影术的基本过程可分为以下几步:（1）同位素标记物与细胞的结合A. 用培养基稀释同位素标记物，培养细胞放射自显术常用浓度为 0.1～2 μ Ci/ml。如采用 3 H-TdR，建议浓度为 0.5～1 μ Ci/ml。B. 弃去培养细胞的培养基，用 Hanks 缓冲液洗涮 1 次，加入上述含有同位素的培养基。一般 50 ml 培养瓶加 3 ml 培养液。C. 将上述细胞置 37 ℃ 恒温箱温育一定时期（温育时间按实验要求和同位素种类及浓度等因素而定，一般如 3 H-TdR 在 1 μ Ci/ml 浓度下，温育 1～4 h 即可），然后弃去培养液，用 Hanks 液涮洗 3 次，以去除未掺入细胞内的放射性物质。（2）固定按常规细胞学方法进行，但应避免使用含有重金属离子的固定液，以免增加本底颗粒数目。建议用纯甲醇固定，时间 30 min 以上。（3）涂布乳胶A. 乳胶的准备于暗室中红光下，将核 IN 乳胶从不透光的容器中取出，置于 10 ml 小烧杯中，将小烧杯置于电磁搅拌器上，放入洁净铁芯小玻棒 1 枚，开启电磁搅拌器，使乳胶化，为稀释起见，可加入适量附加液或三蒸水，搅拌数分钟使乳胶与附加液充分混合均匀。如无电磁搅拌器，可将三蒸水 40 ℃ 预热，然后加入等量或 2/3 量的核 IN 乳胶，用干净玻棒搅拌均匀，应避免出气泡。B. 将生长有培养细胞的小盖片条（或培养皿中的方盖片）取出，将其一端用胶布粘于载片上（注意：使有细胞的一面朝上，此面外观较粗糙），然后在有细胞的盖片上滴 1 滴乳胶，用吸管将乳胶轻轻涂开。C. 将上述涂有乳胶的玻片直立于切片架上，使乳胶尽量成为薄层，再以低速小风扇吹干。D. 待乳胶干硬后（10～20 min），将片子置于预先置有干燥剂（常用硅胶或氯化钙）的曝光盒内，用黑纸将曝光盒包严，注明同位素标本记号，置 4 ℃ 冰箱内，或室温下曝光。（4）曝光曝光时间随标本的放射性强度、同位素剂量和实验要求而定。为阐明同位素在细胞和组织内的精确定位，曝光时间要短；为了显示小量放射性同位素的定位，曝光时间宜长。对半衰期长的同位素，活性小的标本应相应地增加曝光时间。为选择最佳曝光时间，可参考同类的工作，一般应进行试验性曝光，以决定最佳曝光时间。3 H、C、35 S 标记物通常曝光 3～7 d 即可。（5）显影与定影显影与定影时间随曝光时间和同位素剂量而不同，在一般照相的显影液中，于 18～20 ℃ 时，显影 3～5 min，然后在 1% 乙酸溶液中置 1～3 min，再转入定影液内 30 min 左右。（6）染色将标本用自来水连续冲洗数分钟（切忌水流过急、过大），再以三蒸水洗涮 1 次，晾干后用吉姆萨染色（也可用 HE 染色）。（7）封片染色后晾干，用中性树胶封片，在油镜下观察、摄影。注意事项
1. 涂布乳胶有各种方法，其原则是涂布要均匀一致，此外尽可能地要稀薄。2. 从涂布乳胶开始须在暗室内进行，直至定影完毕方可见光。3. 同位素废弃物处理须严格按要求执行，不可污染环境。以上就是本期的内容，更多资讯，欢迎点击安培生物网站链接了解更多技术与产品资讯。
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