细胞消化步骤

      养过细胞的小伙伴们肯定都知道，细胞养得好不好就看细胞传代是的操作手法好不好了。因为悬浮细胞是可以不用消化直接离心收集沉淀就好，基本没有操作难度。所以今天我们主要来聊一聊贴壁生长的细胞的传代操作方法。

      贴壁生长的细胞当在培养瓶内长成致密的单层后，由于继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也会增多时，即细胞密度长到80%-90%时，则说明需要对细胞进行传代操作来分瓶培养或者冻存处理。

      实验室时内最-常用的传代方法是胰酶消化法。一般细胞系和较常见的原代细胞都可以使用胰酶消化法来进行细胞的消化处理。不过，这种方法对操作者的手法要求较高，毕竟如果消化不足吧，细胞下不来，或者细胞还是聚团状的；消化过头了吧，对于细胞的损伤较大，不利于细胞的长期培养。那么，今天我们就来聊聊关于胰酶消化的那些事吧。

      首先，小伙伴们要做好实验前的准备工作哦，要知道消化时间就那么几分钟，如果准备不充足，可能消化时会手忙脚乱严重的更是导致细胞消化过度呢。所以，我们来看看有哪些实验前的准备工作要做吧。

      为了不刺激细胞，同时使胰酶的消化效率-最高，我们需要将消化时要用到的试剂，比如胰酶，终止液，培养基等，提前放入37℃水浴锅内进行预热处理呢。

小伙伴们一定要加强自己的无菌意识。良好的无菌意识是细胞实验成功的前提，所以我们要提前做好消毒措施。实验前打开超净工作台的紫外灯开关，紫外消毒至少半小时。工作台消好毒后，用75%酒精擦拭工作台表面，点燃酒精灯，（注意酒精灯的火焰不能太小也不能太大，安全也很重要，不要烧到手），然后将预热好的试剂（用75%的酒精擦拭试剂的表面，擦干，小心瓶口过火的时候未擦干的酒精燃烧）放入工作台，同时准备好需要的一次性滴管，离心管之类的耗材。正确摆放需使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染的概率。

      提前在离心管上写好细胞的名称并将胰酶中止液加入到离心管中，保证中止液的量是所加的胰酶的量的2-3倍。否则可能导致中止不完-全，细胞消化过度。

      准备工作做好了，就要开始进行细胞的消化了。消化的过程要做到忙而不乱，有序进行操作。由于一般的消化时间也就只有2-5分钟左右，所以操作时不能太慢，比如已经看见细胞消化完-全了，结果操作时加入中止液用了30秒，那这样的话则完-全无法避免细胞消化过度这种事情的发生了。当然，因为着急怕细胞消化过度而导致忽略了无菌操作也是不可取的。

      消化之前用PBS洗涤一到两遍，是常见的操作，因为培养基中的血清含有抑制胰酶的蛋白。小心吸出旧培养基，用PBS清洗（冲洗），然后加入适量消化液（胰蛋白酶液），一般来说，细胞系的消化用0.25%的胰酶，而原代细胞的消化则需要用更温和的0.05%的胰酶。注意消化液的量以盖住细胞表面最好，一般T25瓶中加入1ml左右，T75瓶中加入3ml左右即可，最佳消化温度是37℃。将加好胰酶的培养瓶放入培养箱中消化，记录好消化时间。

      胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。

      而且细胞的消化时间是没有一个准确的数值定论的，同一个细胞同一个人操作，第一次和第二次的消化时间也不尽相同，毕竟人操作的如拧紧瓶盖，走路从工作台到培养箱的时间等不可控的因素太多了。所以我们只能记录一个大概的时间范围，那么，下次再次消化这种细胞时可提前设定好时间，提前将消化的细胞拿出培养箱防止消化过度。

      一般书上都说要在显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。实际上当我们真的这样操作时，可能细胞都有一点点消化过度。不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈流沙状移动时，其实细胞的消化已经可以了。很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完-全分离细胞，这是没有必要的。一般细胞呈流沙状移动了，说明细胞与培养瓶的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，说明细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候就应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止，这样会导致细胞消化过度。细胞就是完-全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死的活的细胞都是如此。小伙伴们如果不信，可以在平时消化细胞的时候观察观察，也可以尝试一下，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养的细胞也是如此，容易聚集生长，所以不要去尝试过几个小时就把细胞拿出来吹打几下，直到细胞分散成单细胞悬液（看到这里，有些小伙伴可能觉得很好笑，但是这个是初养悬浮细胞的小伙伴们经常犯的错误，以为悬浮培养的细胞就是一个一个分开的）。细胞只要能从基质上脱离下来，即使这个时候是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者像有的同学那样吹打1h，等待单细胞悬液出现，这样会导致细胞消化过度，细胞裂解甚至死亡。    观察到细胞脱落，那么就只剩下最后一步，细胞的消化就基本完成了。将消化好的细胞悬液加入到含中止液的离心管中，并用中止液润培养瓶，中止细胞消化。同时，用滴管轻轻将已经消化细胞吹打成细胞悬液。平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟，收集细胞沉淀，那么，细胞消化的过程就已经完成，小伙伴们可以继续接下来的传代或者冻存的操作了。

      事实上，除了常见的胰酶消化外，也有许多小伙伴不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA联合作用的方式来进行消化。但是，小伙伴们，你们要明白，胰酶的作用是切断细胞与培养基质之间的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA则是通过螯合Ca离子，从而作用于Integrin的活性，来使细胞与培养基质分离。所以综合而言，EDTA的作用更加温和。当然也有一些人在胰酶里添加一些EDTA，或者在对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，也是同样的道理。注意EDTA是不能被血清中和的，使用EDTA消化细胞后原先的培养瓶要彻-底清洗，否则再培养时细胞容易贴壁不牢。

      在遇到特别难消化的细胞，小伙伴们不要试图通过延长消化时间（如果10min还消化不彻-底的话）的方法来使消化完-全，而应该想想其它办法。消化比较难消化的细胞时，注意需要用不含Ca，Mg离子的DPBS来进行润洗，因为这些离子也会抑制胰酶的活性。同时一般可以先用少量胰酶进行孵育再来进行消化，但也不需要加入很多胰酶，一般来说100 mm皿，一次最多加入500ul胰酶来孵育就已经足够了。通常来说，对于难消化的细胞，使用这样的消化手法，一般不超过5min，就可以看见细胞成流沙状移动，这时即应该停止消化。

      当然，当在显微镜下看见贴壁的细胞成片或者聚团生长时，不要以为成片分布是自己没养好，消化的时候没有消化完-全，这个要视细胞而定。如果和标准形态不一致，那有可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，也观察到细胞消化完-全了，却仍然成片分布，甚至完-全吹打成单细胞悬液，细胞在贴壁后仍然成片分布，那么可以肯定这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会越来越不好，甚至导致细胞的死亡。

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