小鼠MSC细胞的提取操作

      MMSC细胞一般采用，长骨解剖和骨髓分离程序，总体目标是快速、系统地取出长骨，并收集骨髓细胞进行进一步的实验分析。这种方法有助于回答有关骨髓生物学、肿瘤转移和免疫学的关键问题。这项技术的主要优点是解剖过程快速、标准化，骨髓分离程序相当无菌，首先处死小鼠并将小鼠置于仰卧位。

      然后将小鼠的四个爪垫固定在踝关节下方，用70%乙醇喷洒小鼠，彻-底冲洗腿部。下一步，在臀部正上方的下腹部中线右侧做一个小切口，将切口向下延伸到腿部，穿过踝关节。拉回皮肤。

      然后切开固定在股骨近端的股四头肌，露出大腿骨的前侧，并用销钉将肌肉从腿部固定出来，与木板成45度角。用剪刀抵住股骨后侧，从膝关节上剪下腘绳肌。然后将固定在股骨近端的皮肤和腘绳肌向后拉，露出骨的后侧，并将腘绳肌从腿部固定出来，使固定销成45度角。

      用镊子抓住股骨远端，刚好在膝关节上方。然后引导股骨干两侧的剪刀刀片朝向髋关节。到达股骨头后，扭转剪刀，将顶部刀片直接移到股骨头上方，使股骨脱臼。

     用镊子抓住股骨干的顶部，从股骨头上切下软组织，将股骨从髋臼中取出。然后将整个腿骨，包括股骨、膝盖和胫骨向上拉离身体，小心地切断连接腿部与皮肤的结缔组织和肌肉。当所有的结缔组织都被移除后，拉伸踝关节并扭转剪刀，使胫骨脱臼。

      抓住胫骨远端，注意不要切断肌腱，将胫骨向上拉离身体和钉板。然后去除任何残留在膝盖长骨上的结缔组织，以及任何附加在股骨和胫骨上的肌肉或结缔组织。抓住股骨，使髌骨朝外，股骨头朝下。

      过度伸展膝关节，扭动剪刀，使胫骨与股骨脱臼。然后移除所有连接股骨和胫骨的结缔组织。下一步，抓住股骨，使前侧朝外，股骨头朝下，然后将剪刀沿股骨干向上引导至髁部。

      轻轻地来回旋转剪刀，去除髁突、髌骨和骨骺，露出干骺端。然后，用镊子、剪刀和低尘擦拭纸去除任何附加在股骨上的肌肉或结缔组织。下一步，抓住胫骨，前侧朝外，踝端朝下。

      如果胫骨骨骺完好无损，将剪刀沿胫骨轴向上引至髁突处，轻轻来回转动剪刀，将髁突和骨骺切除，露出胫骨干骺端。然后移除任何附加在胫骨上的肌肉或结缔组织，如刚才所示。为了获取骨髓，首先用一根18号的针穿过一根0.5毫升的微量离心管的底部。

     然后把长骨放进管子里，膝盖朝下，盖上盖子。将0.5毫升的微型离心管放入1.5毫升的微型离心管中，并在大于或等于10000倍g的微型离心管中离心15秒。通过目视检查确认骨髓已经从骨头中旋出。

•使用10mL注射器，抽出骨髓细胞

•转移至50mL锥形管中，用FSB将体积增加至50mL

•将50uL样品转移到eppendorf试管中，并进行细胞计数

•以1200转/分的转速旋转细胞8分钟

•从离心细胞中倒出上清液，转入干细胞完-全培养基中进行培养

       正常培养第一天                    正常培养第三天

提取的小鼠的MMSC-bm             

间充质干细胞完-全培养基进行纯化和培养。

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