怎么使用GSIS方法检测细胞胰岛素分泌

Min6细胞是这次赠送活动中很多客户选择的细胞，一共送出去有50多株，随之而来的就是问胰岛素的检测，很多客户检测出来只有低表达。

Min6细胞培养需要注意三点：

1.细胞易聚团，消化的时间表面上看会非常短暂，大约30秒会全部脱落，脱落后请延长消化时间到2分钟后，再中和，细胞后期聚团会减少。

2.活细胞运输的时候会漂浮，请收集培养基离心，离心后重新铺板以完-全培养基刚没过细胞为准，完-全培养基加太多会导致细胞浮力过大，贴壁不上。

3.培养基请一定要加0.05mm的β-Mer

以下是我们检测使用的buffer和protocol，步骤不能少，一步一步的来。

Buffer的配制：

NaCl 114mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, MgSO4-7H2O 1.16mM, NaHCO3 25.5mM, CaCl2 2.5mM, HEPES 20mM, 0.2% BSA --> pH 7.2-7.5（一定要控制PH值范围）

操作步骤：以2mM glucose 和25mM glucose 为例:

细胞铺板每孔大约2000个细胞，铺板前三天左右脱抗生素采用灭活血清+β-Mer培养1640+10%FBS(灭活）+0.05mm β-Mer；在96孔板中培养24小时，然后将培养基改为含2mM葡萄糖培养基过夜。

1.去除培养基，1 x PBS清洗细胞5分钟

2.基础缓冲液(2mM 葡萄糖) ，2小时孵育 -- > 培养

3.去除上清液 -- > 1 x pbs 清洗，请注意不要触碰底面

4.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小时孵育

5.收获上清液 -- > 1 x pbs 清洗，请注意不要触碰底面

6.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小时孵育；

7.收获上清液 -- > 1 x pbs 清洗，请注意不要触碰底面

8.上清液取样 -- > 1500转，5 min，4度；

9.细胞裂解---- > 蛋白质定量---- > 上机

以下为检测结果：

注意点：

为了确保细胞分泌的胰岛素混合到上清液样本中，可以在培养期间在100-300转的平板振荡器上轻轻搅动细胞。

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