原代细胞怎么永生化

原代细胞都无法扩增几轮增殖，这被称为Hayflick极限，因为每一轮的增殖都会缩短端粒。当端粒达到临界缩短长度时，DNA损伤被触发，导致细胞衰老，如果你试图培养一个珍-稀原代细胞群，当心它最终会死亡，可以对细胞进行操纵，以绕过衰老过程并变得不朽，原代细胞永生化就是有这么神奇的事情。

自发性永生化细胞最-好-的例子就是癌细胞，它们可能经历了抵抗衰老的基因变化，并且开始“长生不老"。其实许多癌细胞株也没有这种变化，事实上，乔治·盖伊（George Gey）这位科学家创造了第一个永生的、可以说是最著名的细胞株：HeLa细胞，他在偶然发现亨丽埃塔（Henrietta）手术后的肿瘤内有高度化生长子宫癌细胞，在此之前，他测试了数百个癌细胞以获得永生的方法，但是都失败了。

许多病毒基因影响细胞周期，因此可以通过消除增殖控制的生物刹车来克服衰老。其中许多是肿瘤抑制基因，因为它们需要抑制肿瘤的发生。其中最常见的是猿病毒大T抗原（SV-40）的过度表达，它抑制细胞的Rb基因和p53基因，这两种基因都是细胞生长周期的关键控制器。SV40永生化的细胞系著名的例子是HEK293T，也称为293T细胞，这是一种广泛用于表达病毒颗粒和细胞分析的细胞系，因为它们很容易转染。其他病毒基因包括来自人乳头瘤病毒（HPV）的基因，如E6和E7，它们也以Rb和p53基因为靶点，比如人支气管上皮细胞HBE-E6E7等。

最著名的不朽基因是端粒酶（hTERT）。端粒酶是一种核糖核蛋白，能够延长端粒的DNA序列，从而减缓衰老过程，使细胞经历无限的细胞分裂。事实上，端粒酶最近被认为是一种逆转衰老的潜在机制。使用端粒酶逆转衰老的问题在于，端粒酶表达增加也会诱导肿瘤生长。事实上，许多用于创造永生化细胞系的基因，如hTERT和SV40，都会诱导肿瘤形成。因此，毫不奇怪的是，hTERT经常在人类肿瘤中过度表达，从而赋予癌症的一个关键特征：不受限制的增殖。这正是我们在使原代细胞系永生化时使用它的目的！

在某些类型的细胞中，仅使用一种永生化方法可能会产生少量永生细胞。因此，根据您的细胞系，将肿瘤抑制因子（如上述细胞周期抑制剂）的抑制和hTERT的表达结合起来以增加更多的细胞永生化的可能。如果你想使你的细胞系永生化和转化（即使其像致瘤细胞一样），也建议使用这种双重方法，因为有证据表明，如果没有永生化，一些细胞系就不能进行有效的转化。

如何将永生引入原代细胞系

以上许多不朽的来源都是基于对原代细胞的基因操作。这需要将外源DNA导入细胞。由于许多原代细胞难以转染，因此将基因改变引入原代细胞的最-简-单和最-有效的方法是通过病毒感染。

最-流-行的方法是通过复制缺陷慢病毒，因为它们比腺病毒安全，腺病毒具有重新感染细胞的能力，因此含有活病毒的时间更长。逆转录病毒也可用于转染细胞，然而，它们只能感染活跃分裂的细胞，从而减少可能被病毒转导的细胞数量。

警告：原代细胞不朽可能不是最-好-的途径！

通过将基因改变引入细胞，你可能正在深刻地改变细胞系的表型。虽然这确实使你的细胞系在某些方面更有用：它可能使你的细胞更同质，从而可以轻松复制结果，你可以创建大量细胞供将来使用，并且它们可能更容易实验，但使用原代细胞系仍然有许多好处，原代细胞可以保持正常细胞的新陈代谢，可以维持正常细胞的生理特征，并且具有实验的统一性和重复性，但随着原代细胞的永生转染，细胞群体和细胞机制发生改变，这可能会混淆您的实验，并导致不确定或错误的结果。此外，关于永生化细胞如何准确地模拟真实组织还有很多争论。

尽管存在争议，但SV40不太可能感染人类，尽管SV40的作用机制：p53和Rb突变可能是人类肿瘤中非常常见的突变。因此，重要的是要确定最佳的基因操作来使用永生你的细胞类型。

尽管永生化细胞在实验研究中的效用非常强大，但在使用中必须接受一些警告。与任何实验模型一样，永生化细胞只是您预期细胞系统的模型。

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