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神经胶质细胞培养实验
发布时间： 2023-01-05 点击次数： 928次材料与仪器
大鼠
CMF-Hanks液 胰蛋白酶 DMEM F12
水浴锅 培养箱步骤
一、原代培养
1. 选用生后1周的新生大白鼠，用碘酒,酒精棉球消毒，断头取其大脑皮层组织。
2. 解剖显微镜下，剥离脑膜，切除大脑髓质部分。
3. 将大脑皮质在无Ca2+、Mg2+Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。
4. 室温下静置10 min。
5. 在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30 min。
6. 加入少许含20%血清的DMEM/F12(DMEM与F12为1:1)混合培养液(下同)，用吸管稍加吹打至胰酶液与培养液混匀。离心5 min(1 000 r/min)。
7. 吸去上清含酶液，重新加入含血清培养液，用吸管反复吹打至组织块消散为止。制成细胞悬液(暂称初细胞悬液)。
8. 将初细胞悬液接种到玻璃瓶(或培养皿)中，于37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min。
9. 翻转培养瓶,吸出瓶中的细胞悬液。用孔径为75μm的不锈钢网过滤。
10. 将滤过液离心10 min(1 000 r/min)，浓缩成约3ml的细胞悬液(暂称为次细胞悬液)。
11. 将次细胞悬液种植到预先涂布有多聚赖氨酸的培养瓶中。接种的细胞密度约1×104个/cm2。
12. 置CO2培养箱中培养3-5h,再补加足够的培养液,继续培养9-14 h。培养液颜色略微变黄时换液。
二、原代培养物的传代
1. 吸取旧培养液用CMF-Hanks液洗涤2次。
2.加入少许0.125%的胰蛋白液消化15 min。以有血清培养液终止胰酶活性。
3.稍事手动摇晃,倒掉含酶液。加入有血清培养液。
4.用吸管反复吹打使细胞从培养瓶壁脱落。收集细胞悬液,离心10 min(1 000 r/min)。弃上清液，给细胞沉淀物再加入培养液制成细胞悬液。
5.重复原代培养时8-10步。
6.将细胞悬液按0.5×105个/cm2的密度种植在经鼠尾胶原包被的培养瓶中。
7.送入CO2培养箱中培养3-5 h，再加足够的培养液,继续培养。
三、结果分离的大鼠大脑皮质细胞在原代培养4 h后，部分细胞即可长出细小胞突。培养3-4 d之后，细胞数量便明显增大。大鼠大脑皮质细胞原代培养一般在9-14 d，以星形胶质细胞为主的细胞即可长满培养瓶壁。
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