分离人脐静脉内皮细胞

D-PBSA 胰蛋白酶 EDTA 人脐带 胶原蛋内酶H 冷的新生小牛血
Hank平衡盐溶液 HBSS PSG 70%乙醇 HUVRC生长培养液
培养瓶 手术刀和22号刀片 手术针 20ml注射器 鳄鱼夹 动脉夹 尖头剪棉纸 铝箔 塑料薄膜或莎纶封皮 软木板 很坚韧的线 Luer接合管

内皮细胞的分离

1. 用铝箔覆盖软木板。

2. 将棉纸铺在铝箔上面，然后用 70 % 乙醇浸泡。

3. 挤出脐带中的血液。

4. 切除脐带一端 2 cm 或 2 cm 以上，包括动脉夹痕迹处。

5. 将 Luer 接合管外套插入静脉。

6. 用针将脐带钉在软木板上，但注意勿穿经血管腔。

7. 用手术刀和手术镊剥出一段静脉，长约 2 cm。

8. 缝线固定接合管，紧紧打结两次。

9. 夹闭脐带另一端，将 20 ml 注射器接在接合管上，再将 25 ml D-PBSA （放在冰上）注入脐带。靠 D-PBSA 的压力将静脉扩张。检査脐带是否有小孔。如有小孔，用鳄鱼夹夹持脐带，使小孔闭合，但不要夹闭静脉。

10. 将 D-PBSA 自脐带排人废液瓶。

11. 切除脐带另一端，插入接合管，如步骤 8 缝线固定。

12. 用另一只注射器将 25 ml 胶原蛋白酶液（胶原蛋内酶 H：是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的（1074059，Roche）。0.5 mg/ml， 用 M199 配制 25 ml）注入脐带，直至脐带膨胀。

13. 用乙醇喷过的塑料薄膜将脐带包裹，在 37°C 条件下放置 8 min。

14. 将胶原蛋白酶液挤出脐带，同时回抽注射器。

15. 拔出注射器，将胶原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS（冷的新生小牛血清，5 ml） 的试管。

16. 在脐带另一端换注射器，将 25 ml D-PBSA 注入脐带。

17. 挤压或拍打整段脐带一会儿，然后用此端的注射器抽取 D-PBSA。

18. 将抽取的 D-PBSA 注入在步骤 15 使用的试管。

19. 在 4°C  条件下离心（210 g，10 min）。

20. 用 5 ml HUVFC 生长培养液混悬细胞。

21. 吸去培养瓶内多余的明胶溶液，接种细胞。

22. 第 2 天从培养瓶吸去培养液。

23. 用 D-PBSA 洗两次，然后加入 HUVEC 生长培养液（M 199 培养液，添加 Hank 盐、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、20% FBS、150 U/ml 青霉素和链霉素混合液以及从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS）。使用 Roche 公司生产的 EGGS （1033484，75 mg）时，25 μg/ml，并用 5 μg/ml 肝素，也可使用 Sigma 公司的产品（E2759，15 mg），30 μg/ml，并用 10 μg/ml 肝素）。

维持培养

24. 吸去一半培养液，加入新鲜培养液，每周 3 次。

25. 大约每周传代一次。将胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培养瓶，收集细胞，然后按 1 : 2 传代。

26. 不要使用超过 6 代的细胞。