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Feulgen反应显示细胞中DNA

发布时间： 2023-01-13　　点击次数： 1478次

简介
Feulgen反应由Feulgen在1924年发明，是一种传统的、也是最为经典的通过化学染色来特异性显示细胞中DNA的方法。
原理
Feulgen反应显示细胞中DNA的基本原理是首先采用稀酸作用于DNA，使其脱去嘌呤碱，暴露出游离醛基，该醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物，细胞中存在有DNA的部位即呈现紫红色阳性反应。如图3-1中所示，碱性品红是红色物质，能与产生SO2的试剂作用形成无色产物，即Schiff试剂，它可以与DNA水解释放出的醛基结合而氧化为紫红色化合物。
用途
Feulgen 反应显示细胞中 DNA 既可检测细胞或组织中 DNA 的存在部位及分布，也可利用其显色强度与 DNA 含量成正比的特性，用于对细胞或组织中的 DNA 含量进行测定。由于反应对含有 DNA 的核结构显示细致、清晰，染色稳定，有利于鉴别不同核结构和分化程度的细胞，如白血病细胞等。
材料与仪器
器材：
尖头镊子、染色缸、盖片、载玻片、吸管、吸水滤纸、普通光学显微镜、恒温水浴箱、CO2培养箱、HeLa人宫颈癌上皮细胞。
试剂：
①Hanks液

（1）原液甲NaCl 160 g ，KC18 g ，MgSO4•7H2O2 g ；MgCl2•6H2O2 g ，溶于800 mL 蒸馏水中。CaCl2（无水）2.8 g ，溶于100 mL 蒸馏水中。将两种液体混合后，加水至1000 mL ，用滤纸滤过，再加2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱备用。
（2）原液乙 Na2HPO4•12H2O3.04 g ，KH2PO41.2 g ，葡萄糖20.0 g ，溶于800 mL 蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加0.5％酚红80 mL ，再加水至1000 mL ，最后加入2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱备用。
（3）使用液甲乙两液各1 份，双蒸水18 份，混匀分装，经101 bf ／in （68.9 kPa ）15 min 高压灭菌后置4 ℃ 冰箱中保存。临用前用无菌的5.6％NaHCO3 调至所需 pH 值。）
②1 mol ／L 盐酸
③Schiff 试剂
（碱性品红0.5 g 加入100 mL 煮沸的蒸馏水中，持续煮沸5 min ，并随时搅拌，使之充分溶解。然后将其冷却到50 ℃ ，过滤到棕色瓶中，加1 mol ／L HC110 mL ，冷却至25 ℃ 时加入1 g 无水亚硫酸氢钠（NaHSO3），需充分振荡后，避光过夜。次日取出（呈淡黄色），加0.25 g 活性炭剧烈振荡1 min ，过滤后即得 Schiff 试剂，此时溶液应完-全无色。避光、低温、密封保存。用前应事先取出使其恢复至室温。）
④ Carnoy 固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）
⑤0.5％亮绿
⑥蒸馏水
⑦70％乙醇
⑧80％乙醇
⑨95％乙醇

⑩无水乙醇
⑪二甲苯
⑫中性树胶
步骤
Feulgen 反应显示细胞中 DNA 的基本过程可分为如下几步：
A.将培养的 HeLa 细胞接种于盖片，24～48 h 后生长为单层。
B.取细胞盖片1 张，用 Hanks 液（pH 7.2～7.4）漂洗3 次，吸水滤纸吸干液体。
C.放入 Carnoy 固定液中固定30 min 。
D.蒸馏水洗3 次。
E.将盖片置于1 mol ／L 盐酸中，60 ℃ 水浴水解10 min 。
F.蒸馏水洗1 次。
G.将盖片移入 Schiff 试剂中，暗处反应30 min 。
H.流水冲洗5 min 。
I.蒸馏水洗3 次。
J.0.5％亮绿复染1～3 min 。
K.70％乙醇→80％乙醇→95％乙醇→无水乙醇梯度脱水。
L.盖片浸入二甲苯中透明5 min 。
M.滴1 滴中性树胶于载玻片上，将盖片细胞面朝下封片。
N.镜下观察。
注意事项
1.本实验的关键步骤是有效地控制DNA水解的程度，包括稀酸的浓度，水解的时间、温度等。水解不足，会使游离醛基的暴露不完-全，反应变弱；水解过度，会导致 DNA 异常降解，也同样使反应变弱，染色深度下降，严重时出现阴性反应。一般的水解时间应控制在10～15 min ，同时应考虑不同标本材料的影响。
2. Schiff 试剂的质量也是影响实验结果的重要因素，试剂暴露于空气中易被氧化而变成红色，使试剂失效。操作及保存中不宜过多暴露于空气，并应注意避光。
3.本实验采用盖片培养细胞，因此在整个操作过程中，应注明盖片的正反面，防止破坏细胞面，尤其在进行流水冲洗步骤时，应避免水流直接接触细胞面。

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