-
一氧化氮合酶组化显示法
发布时间： 2023-01-13 点击次数： 698次简介
细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的辅酶，可以将孵育液中的底物脱氢，然后将氢传递给硝基四氮唑蓝（NBT），使后者还原成蓝黑色沉淀。
原理
一氧化氮合酶组化显示实验的基本原理是细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的辅酶，可以将孵育液中的底物脱氢，然后将氢传递给硝基四氮唑蓝（NBT），使后者还原成蓝黑色沉淀，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位。
材料与仪器
器材：
染色缸、载玻片、盖片、24孔板、毛笔、解剖器材、灌注器材、冰冻切片机、湿盒、恒温箱、冰箱、普通光学显微镜、大鼠。
试剂：
①孵育液（NADPH、NBT）（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ；硝基四氮唑蓝(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;②0.1 mol ／ L 磷酸缓冲液（PB）（磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O），3 g ；磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O），29 g ；加少量蒸馏水，调 pH 7.2～7.4，最后定容至1000 mL ）;
③1％Triton X-100。④3％Triton X-100⑤1％中性红⑥梯度乙醇⑦0.01 mol ／ L PBS⑧4％多聚甲醛⑨中性树胶步骤
一氧化氮合酶组化显示实验的基本过程可分为如下几步：
（一）脑组织冰冻切片
A．将大鼠常规灌注固定，取脑组织块，浸30％蔗糖后行冰冻切片（片厚40 μm ）。B．将切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸缓冲液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ，重复3 次 。C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中，室温，预浸60 min 。D．浸入孵育液中孵育，37 ℃ ，3 h 。E．3％Triton X-100,4 ℃ ，过夜。F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重复3 次 。G．裱片，风干。中性红复染。H．常规脱水、透明、封片、观察。（二）细胞爬片或甩片
A．细胞爬片或甩片，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重复3 次 。B．4％多聚甲醛固定，室温，30 min 。C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ，重复3 次 。D．按上述脑组织冰冻切片步骤（3）～（6）操作。E．中性红复染，常规脱水、透明、封片、观察。注意事项
1．冰冻切片采用的是漂浮法，有利于孵育液充分进入组织。2．本方法属于酶组化，要选择适当的固定液和恰当的固定时间和方法，否则会影响酶的活性。3．此方法加 Triton X-100 可以改善着色效果，降低非特异性背景染色。但 Triton X-100 预浸时间不能超过2 h ，孵育液中 Triton X-100 浓度不能高于2％，否则影响着色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 难溶。以上就是本期的内容，更多资讯，欢迎点击安培生物网站链接了解更多技术与产品资讯。
安培生物科技有限公司介绍：
安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户，提供*细胞体内可代谢的核酸转染试剂；inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产，包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等，为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务；提供以植物生物为平台基因序列全人源化、*的细胞培养可分解3D基质胶产品；提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务，努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。
- 下一篇：一氧化氮合酶免疫组化显示实验
- 上一篇：Brachet反应显示细胞中DNA和RNA
销售热线
