还原糖和总糖的测定

各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻-底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖将3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅的程度呈一定的比例关系，在540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9 即为实际的总糖量。

一、实验材料、仪器和试剂

1、实验材料：面粉。

2、仪器： (1) 25ml 血糖管或刻度试管×11；(2) 大离心管或玻璃漏斗×2；(3) 烧杯：100ml×1；(4) 三角瓶：100ml×1；(5) 容量瓶：100ml×3；(6) 刻度吸管：1ml×11、2ml×4、10ml×1；(7) 恒温水浴；(8) 沸水浴；(9) 离心机(过滤法不用此设备)；(10)电子天平；(11)分光光度计；

3、试剂：

(1) 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取 100 mg分析纯葡萄糖(预先在 80 ℃烘至衡重)，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

(2) 3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2NNaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

(3) 碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml 蒸馏水中。

(4) 酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml 70%乙醇中。

(5) 6NHCl

(6) 6NNaOH

二、操作步骤

1、制作葡萄糖标准曲线：

取7支具有25ml刻度的血糖管或试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。


将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5ml蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1-6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

2、样品中还原糖和总糖的测定：

（1）样品中还原糖的提取：

准确称取2g食用面粉，放在100ml的烧杯中，先以少量的蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

(2)样品中非还原糖的水解和提取：

准确称取1 g食用面粉，放在100ml 的三角瓶中，加入10 ml 6NHCl及15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30分钟。取1~2 滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完-全。如已水解完-全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入一滴酚酞指示剂，以6NNaOH中和至微红，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml定容过的水解液，移至另一100ml的容量瓶中，定容，混匀，作为总糖待测液。

(3)显色和比色：

取5支25ml刻度的血糖或刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂。

1、用血糖管比大试管方便。

2、离心比过滤易得清液。

3、标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色

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