植物蛋白质组学和糖基化

1. 前言

与其他真核细胞一样，植物细胞中，糖基化通常发生在分泌蛋白质上，虽然在细胞质蛋白和核蛋白上也发现一些糖基化反应。根据寡糖部分和蛋白质骨架之间的连接方式，可将糖基化分为两种类型：N -糖基化和 O-糖基化。植物中 N-糖基化研究最多。

1.1 N-糖基化

与其他真核细胞一样，在植物细胞中，N-糖基化只发生在进入分泌途径的蛋白质上。它从内质网中的寡聚糖前体 Glc3Man9GlcNAC2 共翻译转移到构成初生蛋白质 ( Asn-X-Ser/Thr，X 可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一种氨基酸）N--糖基化序列的特异天冬酰胺残基上开始，当新合成的蛋白质进入内质网腔后就发生 N 端序列糖基化反应。接着，当糖蛋白从内质网经高尔基体到达其最终目的地时，Glc3Man9GlcNAC2 前体沿着分泌途径进行进一步加工处理。如果糖基侧链能被内质网和高尔基体中的糖苷酶和糖基转移酶加工的话，Glc3Man9GlcNAc2 前体就会被成功转化为 Man9GlcNAc2 和 Man5GlcNAC2 范围内的髙甘露糖型 N-聚糖， 以及复杂形式的 N-聚糖。植物复杂形式 N-糖苷有一个挂在中心的近端氨基葡糖上的 α-1-3 岩藻糖；一个与中心少甘露糖连接的 β-1-2 木糖残基，和/或与它们的末端天线（称为 Lewisa ) 连接的 Gal/β-3  (Fucα-1-4 ) GlcNAc 寡聚糖末端序列，称为 Lewisa[1] 。



1. 2 O-糖基化

在植物细胞中 O-糖基化可分为两种类型。即分泌蛋白糖基化或细胞质/核蛋白糖基化。蛋白质上不同位点的 O-连聚糖的性质不同。

1. 分泌蛋白质的 O-糖基化

对植物分泌蛋白的 O-糖基化的了解还很少。只有少数几篇文章报道了与植物糖蛋白上的一些丝氨酸或苏氨酸残基连接的 O-聚糖。一些糖蛋白，如细胞壁伸展蛋白和液泡中的甘薯贮藏蛋白（sporamin) 都被认为是一类含有一个单半乳糖 O-糖基化的丝氨酸残基的糖蛋白 [ 2，3] 。分析鉴定水稻被转运到液泡的谷蛋白也是为了证明哺乳动物黏蛋白型糖基化的存在，植物中这一类型 O-糖基化依然存在争议 [4] 。第二种类型的分泌蛋白 O-糖基化要求糖蛋白脯氨酸残基的羟基化，我们已发现植物中的富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP)。HRGP 是植物中主要表面糖蛋白。这些定位于细胞壁或细胞质膜外表面的 HRGP，有三类蛋白质：伸展蛋白，阿拉伯半乳糖链蛋白（AGP ) 和茄科凝集素 。伸展蛋白和茄科凝集素含有由丝氨酸- ( 羟脯氨酸 )4 组成的重复序列，这里 的丝氨酸可被 O-糖基化，而羟脯氨酸可被阿拉伯糖链取代 [5] 。这个阿拉伯糖化过程在髙尔基体中发生 [6]。AGP 家族是那些高糖基化的胞外蛋白和细胞质膜蛋白质。其蛋白质部分富含羟脯氨酸（Hyp) 、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸，并含有 Ala-Hyp 重复序列。脯氨酰-4-羟化酶的催化作用可将内质网和/或高尔基体中脯氨酸转换成羟脯氨酸 [ 4，7 ] 。AGP 的 O-糖基化过程是一种添加了被  β-1-6 半乳糖支链取代 β-1-3 半乳糖数组的半寡聚糖支链的羟脯氨酸后的循序渐进的方式，β-1-6 半乳糖支链反过来由阿拉伯糖或者其他的低丰度的单糖依次形成分支。

2. O-GlcNAc 糖基化修饰

另外一种在哺乳动物中得到详细阐述的 O-糖基化形式是细胞质和细胞核蛋白的 O-GlcNAc 糖基化。这种在蛋白质上添加 O-GlcNAc 的修饰，在真核生物中非常普遍，发生在丝氨酸或苏氨酸的 β-连接上。尽管序列 Tyr-Ser-Pro-Tb- Ser- Pro -Sef ( 标有 * 是发生糖基化的氨基酸）代表一类典型的 GlcNAc 连接位点 [9] ，但是对可被  OGlcNAc 糖基化的保守序列还不十分清楚。OGlcNAc 糖基化是一种高度动态过程，而且通常与 O-磷酸化修饰交互进行 [10] 。糖基转移酶的催化作用下，糖基被添加到蛋白质上，而在 OGlcNAc 糖苷酶的催化作用下，糖基被从蛋白质上移除许多细胞活动过程，如蛋白转运入细胞核、转录、细胞骨架附着在细胞膜上或蛋白合成等都参与了这个糖基化修饰，目前对它的确切作用还了解不多。

植物中有关 OGlcNAc 糖基化的报道还很少，与 OGlcNAc 转移酶相似的两个被命名为 SPINDLY 和 SEC 的酶已在拟南芥中克隆出来 [ 11，13] 。它们在离体条件下具有 OGlcNAc 转移酶活性，但还不清楚它们在植物体内的天然底物。此外，有报道将一些细胞核蛋白描述为携带末端为 GlcNAc 的 O-连聚糖的糖蛋白 [14，15 ] 。这些细胞核蛋白是否为 SPIN-DLY 和 SEC 的底物仍是个谜。

1.3 糖基化的异质性

真核细胞的成熟分泌糖蛋白 N-糖基化模式是内质网中的寡聚糖共翻译转运过程和其在内质网和高尔基体内加工的共同结果。多肽折叠因子会影响内质网内潜在糖基化位点 [16] 。结果导致蛋白质中的多个 N-糖基化位点中有些位点为无效糖基化位点，其他一些则未能全部糖基化 [17~19] 。

同时，多糖侧链的修饰加工与其是否接触到成熟的酶相关。虽然被包被在蛋白分子结构内部的寡糖仍然是未修饰的高甘露糖型 N-糖链，但位于蛋白质表面的糖苷将成熟转变为复杂形式的 N-糖苷 [17] 。这种现象也同样发生在 O-糖苷上。因此，要鉴定植物糖蛋白的糖基化，不仅需要鉴定糖-蛋白连接及附着在糖蛋白上的寡聚糖的结构，而且还要确定其在蛋白分子骨架上的潜在糖基化位点的分布/定位。

本章的目的是向植物蛋白质组学工作者介绍一些工具和方法，用于确定所鉴定的蛋白是否为糖蛋白，类别以及蛋白骨架上糖苷侧链的位置。本章的最后部分将论述植物糖蛋白质组学中的糖蛋白鉴定方法。

深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技术实力、壹流的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供壹流的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供世界前沿水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等优质客户提供优质的产品、技术支持与服务。