PCR 引物设计

好的引物会让 PCR 实验成功一半，因而，引物设计一直都是 PCR 非常重要的环节。经典之法就是让 Premier5 携手 oligo，共同设计 PCR 引物。

1、以小鼠的 IL-17 为例，进入 NCBI 界面,选择 Nucleotide 后，输入 IL-17，点击 search。然后选择人类 IL-17 的 mRNA，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置，在下面的 origin 中，
选定目的序列。

2、打开 Primer Premier5 软件，点击菜单栏 File|New|DNA Sequence，在出现的对话框里黏贴目的序列，并在 paste 对话框里选择 As Is，点击 OK。

3、点击 Primer，弹出菜单后点击 search 按钮。在弹出的 Search Criteria 中，选择 PCR primers，Pairs 参数，并选择所需PCR 产物长度，点击 OK。在弹出的 search progress 菜单中，点击 OK。

4、在搜索出的结果列表里选择 Rating 值高，bug 较少的引物#1，在 Primer Premier 中选择 S（正义链）/A（反义链），点击 edit primer，将所得引物改成为 Rating 值为 100，无 bug 的引物，即无发夹（Hairpin）、无二聚体（Dimer）、无错配（False Priming）和交叉配对（Cross Dimer）的引物。点击 Accept and Quit 命令即可。

5、点击菜单栏中 Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer，即可得到设计的引物。

6、接下来，就要用 Oligo 软件验证评估 Premier5 软件所设计的引物，单击菜单栏里 File∣New Sequence 可打开以下窗口，并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。

7、点击菜单栏里 Accept/Discard 中的 Accept，则会出现 Tm、△G 和 Frq 三个窗口, △G 值反应了序列与模板的结合强度，最好引物的△G 值在 5’端和中间值比较高，而在 3’端相对较低。

8、点击菜单栏里的 Select 中的 Upper Primer 将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的 Edit 中的“Lower Primer"命令，在 Edit Lower 窗口中输入下游引物的序列。点击 Accept and Quit 命令即可。

9、最后，在菜单栏中 Analyze 完成引物△G 值、Tm 值、引物二聚体和发夹结构的分析后，可将引物序列送至公司进行合成即可。

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