RT-PCR的无扩增产物

可能原因 1：引物问题（包括：引物设计较差，引物合成较差，引物浓度太低）。

解决方法：设计引物的时候，避免在引物 3'端含有互补序列；避免可以形成内部发卡结构的序列；设计 Tm 类似的引物。针对引物合成的问题，用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。最佳引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。

可能原因 2：探针问题。

解决办法：就要用到我们前面提到的序列分析了。用 blast 对探针序列进行比对，设计符合要求的探针。

可能原因 3：模板问题（包括：模板质量不好，模板浓度太低）。

解决方法：提高模板质量。如果怀疑模板被 DMSO 等抑制剂污染了，坚决采用乙醇沉淀；使用 104copy 的靶序列，然后在 25 到 30 个循环中获得信号。

可能原因 4：不明物干扰。

解决办法：做 RT-PCR 必须非常小心翼翼。对 RT-PCR 的任何实验样品或试剂，均应采用“三无"离心管（即无菌无酶无热源）进行试剂的分装和使用。

可能原因 5：扩增酶问题。

解决办法：不要省钱。买好的扩增酶。分子生物学永远是一分价钱一分货。推荐：选择hot start Taq 酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素。

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