突破瓶颈！人源多能性干细胞培养技术

原理：

人类多能干细胞(HPSCs)具有自我更新能力，但在体外对环境扰动高度敏感，这对其治疗应用构成了挑战。迫切需要进一步的突破，以确保这些细胞安全和稳健的长期生长和功能分化。在这里，通过高通量筛选策略来确定一种小分子混合物，它可以提高hPSCs及其分化后代的生存能力。Chroman 1、Emricasan、Polyamines和trans-ISRIB(CEPT)的组合通过同时阻断几种原本损害细胞结构和功能的应激机制，提高了遗传稳定的hPSCs的细胞存活率。CEPT为干细胞研究中的几个关键应用提供了有力的改进，包括常规细胞传代、多能干细胞和分化细胞的冷冻保存、类胚体(EB)和类器官形成、单细胞克隆和基因组编辑。因此，CEPT代表了一种综合细胞保护的多药理学策略，为高效和安全地利用hPSCs提供了理论基础。

材料与仪器：

人类多能干细胞(HPSCs),二甲基亚砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT，超低吸附（ULA）板

步骤：

1.分离hESCs

2.在二甲基亚砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT存在下将其接种到超低吸附（ULA）板中。

实验结果：

分离hESCs，并在二甲基亚砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT存在下将其接种到超低吸附(ULA)板中。24小时后，观察到显著的差异，因为CEPT不仅产生了最多数量的EBS，而且这些培养物几乎没有细胞碎片(图a)。细胞存活率的显著改善在更可控的条件下得到进一步证实，即在执行细胞计数后在单个井中产生单个EBS。与Y-27632(图e)相比，暴露于CEPT 24小时产生了更大的EBs(图b，c)，最大限度地减少了细胞死亡(图d)，并提高了细胞存活率242%。在用CEPT启动的EBs中观察到了超过7天的强劲和持续的细胞生长，但用Y-27632(图e)没有观察到。因此，在这些条件下，CEPT处理更可靠地产生能够多谱系分化的EBs(图f)。

第30天HE染色的组织学分析显示神经组织分化有显著差异(图g)。前脑标记FOXG1的免疫组织化学证实，使用CEPT产生的有机化合物产生了更多的神经组织，显示出复杂的形态(图h)。与Y-27632相比，CEPT产生的有机体神经分化的改善也被使用大量可获得的核糖核酸测序(rna-seq)数据进行的无偏见转录分析所证实。对热门类别的比较表明，CEPT产生的有机物具有更好的神经分化，而Y-27632处理导致神经和非神经类别，如肾脏、血液和树突状细胞(图i)。当Y-27632再次被CEPT取代时，观察到改善了肾脏类器官的形成。

与Y-27632(图a-c)相比，解冻后的冷冻保存的hESCs(WA09)在CEPT处理24小时后存活率显著改善(约300%)。为了进行更系统的比较，使用了不同的试剂组合来进行细胞的冷冻保存和解冻(图d-g)。有趣的是，使用三种不同的冷冻保存方法(Y-27632、CEPT和商业上可用的mFreSR)影响很小，结果相似，而在解冻期间使用的试剂产生了很大的差异(图d)。因此，在CEPT、Y-27632、Revitacell、Clone或SMC4存在下，所有五个hPSC株系在CEPT存在下显示出比DMSO、Y-27632、Revitacell、Clone或SMC4更高的存活率(图e-g)。此外，由于生物样本库对再生医学至关重要，也证实CEPT治疗在长期储存(用CEPT冷冻保存12个月)以及hESCs、IPSCs和星形胶质细胞解冻后提供了更高的细胞存活率。同样，当长期冷冻保存的细胞在解冻前在干冰上保存72小时以模拟干细胞产品的运输时，CEPT的使用再次显著提高了细胞存活率。

接下来，研究了CEPT是否也可以改善冷冻保存的分化细胞的解冻。从一家商业供应商(Fujifilm CDI)获得的几种IPSC来源的细胞类型，包括心肌细胞、肝细胞、运动神经元和内部生成的星形胶质细胞，在CEPT治疗后显著提高了细胞存活率(图h)。例如，心肌细胞的结果表明与DMSO相比，存活率提高约36%，运动神经元的改善约63%。心肌细胞和运动神经元存活率的提高具有长期的效果，在电镀后多电极阵列测量中，有长达14天的功能活动增强(图i-k)。

实验结论：

CEPT不仅可以减少干细胞在形成EB过程中的凋亡，而且可以促进EB和微器官的生长和分化。同时，CEPT也可以极大的减少干细胞以及干细胞产品在冻存复苏过程中的凋亡。因此，CEPT在人源干细胞的基础研究和临床运用中都有广阔的运用前景。

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