载体构建及原核表达

      大肠杆菌表达载体要求：①有一个强的启动子及其两侧的调控序列；②应有SD序列，且SD序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离；③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。

构建好表达载体之后，提取重组载体的质粒，然后用质粒进行表达宿主菌的转化。

NCBI上查找目的基因SD序列，使用Primer 5软件进行引物的设计，在设计引物时须引入合适的酶切位点和保护性碱基，具体可查看本公众号分享的引物设计。

1.2 PCR扩增（以Q5酶扩增为例）

PCR体系（25 μl）：

1.3 琼脂糖凝胶电泳

      根据目的条带大小配置相应浓度的琼脂糖凝胶，微波炉加热，全部溶解后，冷却至60℃左右，按照1：10000加入核酸染料，混匀后倒入凝胶铸槽中，插入梳子，除去气泡，待全部凝固后拔出梳子。

将凝胶置于电泳槽中，加样孔放置于负极，进行加样（选取合适的DNA Marker），根据DNA Marker指示条带在凝胶上的位置决定电泳是否终止，然后将凝胶放置在凝胶成像仪中切胶回收。

2.目的片段和表达载体的连接（以T4连接为例）

    不同的表达载体具有不同的优势，在分析基因序列之后可以选择最佳的表达系统进行重组表达质粒构建。因科研需求，需要pET系列、pGEX系列、pCold(BL21分子伴侣)系列等原核表达载体。

b. 连接载体酶切：37℃ 1 h

3.目的蛋白的表达

3.1 连接产物转化并挑取阳性克隆质粒

a.从-80℃取出感受态细胞，放在冰上融化；

b.将10μL连接产物全部加入到50 μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min；

c.将EP管放在42℃热激1 min 30 s，速置冰中3 min；

d.向EP管中加入440 μL无抗的液体LB，置于摇床上37℃220 rpm培养1 h；

e.取适量活化后菌液均匀涂布于含抗性（与载体上抗性基因一致）的固体LB培养基上，于37 ℃恒温培养箱中倒置12-16 h；

f.转化后挑取阳性克隆质粒，经测序鉴定无误后进行后续诱导表达实验。

3.2 提取质粒转化BL21

a.将鉴定正确的表达重组质粒转化BL21感受态细胞（和转化同理）；

b.挑取单菌落接种至含抗性（与载体上抗性基因一致）的液体LB培养瓶中，置于摇床上37 ℃ 220 rpm培养过夜；

c.将过夜培养的菌液以1:100的比例接种于含抗性（与载体上抗性基因一致）的液体LB培养瓶中扩大培养；

d.待OD600=0.6-0.8时，取1mL菌液作为未诱导全菌样品对比，并向剩余菌液中加入终浓度为0.5 mM的IPTG，置于摇床上低温180 rpm诱导过夜。

3.3 超声破碎菌液

a.从过夜诱导后的菌液中取1mL作为诱导后全菌样品对比，收集剩余菌液离心（8000 rpm，20 min，4℃）弃上清用PBS重悬浓缩（浓缩比例约10:1）；

b.超声破碎（超声4 s，停歇7 s）至透亮，结束后离心（10000 rpm，30min，4℃）分别收集上清和沉淀，将其作对照组取样；

c.取诱导前全菌，诱导后全菌，诱导后上清，诱导后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer，于99℃变性20min，进行SDS-PAGE电泳分析。

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