CHO细胞培养技术经验分享

简介：
CHO细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）一个转化细胞系，1957年从中国仓鼠卵巢细胞得到。CHO细胞目前是现代制药企业进行研发、生产生物治疗药物 (单抗、酶、激酶和激素等) 中常用的非人类哺乳动物细胞系。

原理：
培养基无特殊要求，可有多种选择,一般用DMEM（高糖）培养基+10%胎牛血清+2%双抗。置于37℃,5%CO2的培养箱培养。每隔48h换液，或当培养基呈现荧光黄色及时换液，否则细胞会出现大规模脱落和变形死亡。

当单层培养细胞汇合达90%以后(两天左右)，弃去培养基，用2ml不含钙、镁离子的PBS润洗2次，用0.5mlPBS+0.5ml 含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培养箱放30s-1min），镜下观察变圆或轻轻击打培养皿侧壁发现有细胞团块脱落或皿底花斑状，用1ml（血清）细胞培养基终止消化，九宫格法吹落细胞收集到离心管，以800-1000rpm，室温离心5min。

以1:2~1:3的比例传代，离心弃去废液，用2ml~3ml（血清）细胞培养基充分重悬细胞沉淀成单个细胞，以“Z"字打入含有7ml培养基的10cm皿中，轻柔十字晃匀不超过十下并静置数分钟后镜下观察，平稳放入培养箱中。

冻存液的配置为血清：二甲基亚砜(DMSO)=9:1。取长势良好，汇合度达90%并无污染的细胞，消化离心后用冻存液1.5ml重悬后转移至冻存管中，标记好细胞种类、日期、姓名，放入恢复室温的梯度冻存盒，一同放置于-80°C冰箱。

准备好离心管中放入3ml（血清）细胞培养基，并确保水浴锅打开并达到37℃，从-80℃冰箱取出目标冻存管，放入密封袋并在水浴锅中迅速摇晃解冻<1min，与3mL培养基混合均匀。在800 rpm，离心5分钟，弃去上清液，用新培养基重悬细胞为单个细胞状态，加入10cm皿中，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

注意事项：

1.CHO细胞对损伤不易耐受，请注意密切观察。

2.不同胰酶消化速度有差别，根据经验调整用量和用时。

3.细胞传代用PBS洗的目的是去除旧培养基中血清对胰酶的抑制作用。

4.不要将细胞中液体吸净后放置过久，细胞变干后死亡。

5.细胞消化所用胰酶的最适工作温度大约在37摄氏度左右，故放入培养箱更好的促进胰酶消化。

6.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，才能最大限度的保存细胞活力。（细胞保护剂（DMSO）能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶形成造成的细胞损伤。复苏时快速融化，避免由于缓慢融化使细胞外结晶的水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤）。

7.细胞冻存严格遵循梯度降温，不可直接放入低温冰箱，如果没有梯度冻存盒，可以4℃ 10-30min，-20℃ 30-1h，-80℃过夜。

8.复苏后第二天换液是为了去除残留冻存液对细胞的伤害。

9.细胞量少或冻存过久的细胞复苏到中皿中，等长满后传代到大皿中。

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