小鼠骨髓细胞染色体标本制作实验

实验原理：

  在小鼠骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞那样要经过体外培养。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素（秋水仙碱）处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。通过骨髓得到染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究，在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，而且用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。

实验方法和步骤：

(一)秋水仙素处理取骨髓前3-4h先给小白鼠经腹腔注入0.1％的秋水仙素，注射剂量为4mg／kg动物体重。

(二)取骨髓经秋水仙素处理的小白鼠，可用损伤脊髓法（断颈法）迅速处死，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿骨和胫骨，用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉33碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后将股骨剪碎投入小烧杯中，用2毫升1％柠檬酸钠溶液搅烂碎骨，使骨髓细胞游离出来。静止片刻，用吸管把悬浮液吸到离心管中，可重复冲洗一次。此时离心管中的细胞悬浮液可达4-5毫升。

(三)低渗将所获得的细胞悬浮液先进行平衡(注意：每次离心前都要平衡)，然后以1000rpm离心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加0.075M KCL溶液至8毫升刻度，将细胞沉淀物吹散打匀，在水浴37℃低渗20-30min。

(四)固定低渗处理后的材料，以1000rpm离心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，用吸管吹散沉淀物，沿管壁加固定液至6毫升,冲匀后静止固定20min，即第一次固定。按上述条件离心，去上清液，再次加入固定液至6ml，进行第二次固定。20min后离心吸去上清液，留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液，冲匀制成细胞悬液。

(五)滴片取事先在冰箱中预冷的载玻片(载玻片须经硫酸洗液浸泡10天以上，经清水冲洗，用蒸馏水浸泡)，滴2-3滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上，用嘴吹气，使细胞迅速分散。将载片插放在切片架上晾干。

(六)染色取2张制片平放在玻璃板上，用10：1 Giemsa染液染色20min，流水冲洗后晾干即可镜检（也可以使用苯酚品红溶液染色）。

(七)观察用中倍镜选择分散适度，不重迭的染色体分裂相，转高倍镜详细观察小白鼠染色体的形态特征，并计算2n的染色体数目。

观察细胞的标准：

1、细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。

2、染色体形态和分布良好。

3、最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。

4、观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。

5、在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。

注意事项

1.提前3-4小时注射秋水仙素，时间太长或者太短都会影响染色体中期的数目和形态。

2.在低渗过程中，时间和吹打都很重要，低渗过渡会导致染色体膨胀，染色后肥胖，低渗时间不够，染色后染色体颜色深，看不出条带。

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