Trizol法和柱式法RNA提取的实验流程和注意事项

实验原理：

（一）Trizol 法

Trizol是一种酸性试剂，能从细胞和组织中快速分离RNA，其主要成分为异硫氰酸胍（GITC）和苯酚。裂解细胞后，GITC能使蛋白质和RNase变性，有利于保护RNA的完整性；加入氯仿离心后，样品分为水相和有机相，RNA存在于上层水相中，而DNA和蛋白质则存在于中间层及下层有机相中，从而达到分离的目的。简单来讲就是裂解细胞使RNA得以释放，加之有机溶剂使RNA与DNA、蛋白质分离，并进一步纯化得到RNA的过程。

试剂、仪器与耗材：

Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase free Water、低温冷冻离心机、匀浆器或组织研磨器、涡旋振荡器、金属浴、微量移液器、通风橱、计时器、1.5ml EP管等。

提取步骤：

1.样品处理：

细胞：贴壁细胞每106细胞加入1ml裂解液，吹打混匀。

悬浮细胞：植物、动物、酵母每10^6细胞加入1ml裂解液。

细菌细胞每107细胞加入1ml裂解液混匀。

组织：新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，匀浆处理。

2.室温放置5min，使核酸蛋白复合物全部分离；

3.向匀浆样品中加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3-5min；

4.2-8℃，12000rpm离心10min。RNA主要存在于上层水相中把水相转移至新的EP管中（注：不可吸到沉淀）；

5.吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2min，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液（小Tips：此步可以在第四步离心还剩2min左右的时候进行，这样第四步离心结束就可以直接进行洗柱，而不需要再等时间）；

6.在收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱中静置2min，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液（注：新买的试剂盒中漂洗液还需要加入一定量的无水乙醇，此步一定要确认漂洗液是否加入无水乙醇），2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液（注：漂洗液在7-8步共加了两次哦）；

9.12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温数分钟（10-15min）以去除残留的漂洗液（注：最好在通风橱进行，以免RNA酶对RNA的降解；通风橱在使用前也可先紫外30min）；

10.将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O（通常取中间值），室温放置5min，12000rpm室温离心2min即可得到RNA溶液（注：所有步骤中仅最后一步离心是在室温，其余均在2-8℃，因此，前几步离心拿出样品后一定要及时关上离心机盖子，以免升温，而在第9步离心结束后就可以打开离心机盖子使其快速升至室温）。

四、 注意事项

1．佩戴手套、口罩，消毒操作台，杜绝外源酶的污染；

2．所用试剂耗材必须无酶化，有条件者可以直接购买，否则就要做好高压灭菌的工作；

3．得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反复冻融，放置时间不可过长；

4．对于组织RNA的提取，一定要充分匀浆处理以使RNA充分释放出来。

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