PCR扩增没条带？关于PCR扩增的技巧总结

简介：

首先，如果你已经设计了引物，PCR扩增没有条带，请这样做：

使用第一次的PCR产物作为模版（1~2ul即可），再进行一次PCR。

那你要重新学习PCR扩增了！这篇内容，涵盖了实验中可能遇到的PCR扩增问题和详细的解决办法，主要是如何培养问题解决问题的思考能力，你必须要知道！

PCR扩增主要包括以下几个组分：1）引物；2）酶；3）dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA。注：现今大部分PCR酶试剂盒一般都是酶，dNTP和Buffer的预混液。

因此，需要从引物，酶，cDNA和DNA模版下手，进行分析。

一共有以下三步：

第一步，一定要确定的是-cDNA。

每个基因在不同组织，不同时期中表达量是不同的。首先要确定你的基因在哪个组织，哪个时期表达最高，确认之后就选这些组织和时期，否则很难做出来。

问题：怎么查找目的基因在哪个组织和时期中表达高？

答：1）数据库。例如NCBI数据库。

2）文章。查询你目的基因的别人做过的文章，看看他们使用的什么。

3）新的基因，没有数据库记载，没有报道，什么都不知道。使用几种组织的混合的cDNA.

第二步：检查你的酶

酶的品质（主要是公司的工艺好不好），活性，保质期，buffer的冻融程度都会很大程度影响PCR扩增。因此，换一个酶是相对简单，必须试用的方法。

第三步：最需要实验经验-引物设计

解决了酶和cDNA的问题之后，需要进行最复杂的引物设计。引物设计是灵活的，根据目的的不同而不同。qPCR引物设计因为可以在序列上随机选择,因此可以使用引物设计引物进行设计，在这里我们主要详解基因克隆的引物设计，一般包括CDS的设计，基因区的设计，非编码区的设计等，这些片段的引物设计一般都固定在一段序列上，不能随意更改（GC含量，TM值都只能固定在一个相对范围内），因此需要一定的实验经验和理论基础，以下为详细的解决方法。

1.GC含量低于40%或高于60%,长度不在18-25范围内，会出现引物二聚体，设计的引物不能遵循引物设计的原则怎么办？

答：不是所有的引物都必须遵循引物设计的原则，也不是所有遵循引物设计设计原则的都可以扩增出来。例如：GC含量为65%，长度为28，如果实在设计不了符合原则的，可以以相对符合的设计方式进行，不必全部符合。

2.设计了好几组引物，都不能扩增出来，怎么办？

酶和cDNA都确定好之后，引物仍然扩不出来条带，对于不同的目的可以使用不同的方法。

①对于鉴定目的基因，只是想要确定这个基因的序列，可以这样做：

在引物两端加一段碱基（5‘的序列可以自己设计），改变引物的GC含量，TM值等。

②对于仅需要扩增目的基因，不能在5’端添加碱基的情况，且使用F2/R2不能扩增出条带，可以这样做：

先在CDS两端设计一对引物，先使用F1/R1进行扩增。然后再使用CDS引物F2/R2进行扩增。

③对于表达载体，需要扩增到载体上，可以这样做：

1）先设计CDS区的引物F2/R2扩增，再使用这个PCR产物作为模版，使用带酶切位点（蓝色为酶切位点及保护碱基序列）的引物F1/R1进行扩增。

2）改变所用的酶切位点。

3）换连接方法。如果使用T4连接，可以换成同源重组的方法。

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