永生化人脑微血管内皮细胞（HCMEC/D3）培养指南

简介：

 HCMEC/D3细胞系来自于癫痫患者手术切除的富含脑内皮细胞（CECs）的组织，并从中分离出人颞叶微血管。后续使用人端粒酶（hTERT）和SV40大T抗原的催化亚基通过慢病毒载体转导，使细胞依次永生化后，通过有限稀释克隆法选择性分离CEC，最终鉴定所得的细胞，具有广泛的脑内皮细胞表型特征。可表达大量内皮细胞；可在基质胶上形成毛细血管样结构；可作为人血脑屏障（BBB）模型。可用于研究内皮细胞，血管，药物摄取与主动转运机制等。

培养条件：

 内皮细胞专用基础培养基-EMC培养基+5%FBS+1%内皮细胞生长添加物和1%青霉素/链霉素溶液。置于37°C，5%CO2的培养箱中培养。

消化（10cm皿为例）：

1. 当单层培养细胞汇合达80%。

2. 弃去旧培养基，2mlPBS润洗两次。

3. 用1ml含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培养箱放1min，然后镜下观察变圆）。

4. 用1ml（血清）细胞培养基终止消化，九宫格法吹落细胞收集到离心管，以800-1000rpm，室温离心5min。

传代：

以1:2~1:3的比例传代，离心弃去废液，用2ml~3ml（血清）细胞培养基充分重悬细胞沉淀成单个细胞，以“"Z“"字打入含有7ml培养基的10cm培养皿中，轻柔十字晃匀不超过十下并静置数分钟后镜下观察，平稳放入培养箱中。

冻存：

1. 冻存液的配置为血清：二甲基亚砜(DMSO)=9:1。

2. 取长势良好，汇合度达80%-90%并无污染的细胞，消化离心后用1.5ml冻存液重悬后转移至冻存管中，标记好细胞种类、日期、操作者，放入恢复室温的梯度冻存盒，一同放置于-80°C冰箱。

复苏：

准备好离心管中放入3ml（血清）细胞培养基，并确保水浴锅打开并达到37°C，从-80°C冰箱取出目标冻存管，放入密封袋并在水浴锅中迅速摇晃解冻<1min，与3ml培养基混合均匀。在1000rpm，离心5分钟，弃去上清液，用新培养基重悬细胞为单个细胞状态，加入10cm皿中，培养过夜。

注意事项：

1.ECM细胞培养基又称内皮细胞培养基，是专门为人类微血管内皮细胞体外培养设计的最合适其生长的（血清）细胞培养基，包括必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清（5%）。

2.该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长。

3.尝试过使用DMEM（高糖）培养基、M199培养基，考虑可能由于不含生长因子，多代后细胞形态发生改变，碎片增多。

4.ECM细胞培养基中的数种成分是怕光的，所以推荐培养基不要长时间暴露在光中。避光4°C保存，配好的培养基需要在一个月内使用。

5.HCMEC/D3细胞十分耐造，正常培养即可。

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