质粒构建的心得分享

质粒是我们日常实验中比较常用的载体，其可以自主生长，也能通过比较容易的方法进行大量扩增，但往往单一的质粒不能满足实验需求，需通过一系列方法进行质粒重组，我目前比较常用的方法也就是比较陈旧的酶切重组质粒的方式，简易实验过程如下图：

在这个过程中，有几个小Tips：

1.原载体的酶切位点由文献、载体说明书或者导师建议得来，选择正确的酶切位点是重组质粒开始的第一步，常见的酶切体系如下：

上述体系适用于大多数酶切，不是特别难切开的载体1μl内切酶足够，酶切前计算好量，先加ddH2O，最后加内切酶。

2.酶切完成后，需要跑琼脂糖胶鉴定酶切效果，配胶时注意选择合适的胶浓度，原则是分子量越大，胶浓度越小。跑胶完成后紫外灯下一般会有两段即为成功：载体和切下来的片段，根据结果进行胶回收，注意切下来的片段不回收，胶回收完成后测浓度备用。

3.插入片段根据自己的实验选择，通常插入片段可以通过PCR而来，或者是一段由三方公司合成的序列，在连接开始前也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见连接体系如下：

其中，加入载体和插入片段的量由说明书得来，加样前计算好量，先加ddH2O，最后加连接酶，由于连接体系较小，一般使用pcr管进行。

4、为确保连接的顺利进行，务必保证连接酶和连接酶缓冲液配套使用，即使用同一厂家的，不能混用。

测序的准确性对于后续慢病毒感染是非常重要的，因此测序公司的选择十分重要，尤其出现一些比较难测的结构如shRNA的发卡结构等，测序技术不成熟的话会一直报重叠峰或者测不通的情况。

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