Trizol法提取RNA：从样本前处理到操作步骤

一、实验原理：

Trizol试剂的主要成分是苯酚，对细胞进行裂解，使细胞中的蛋白质以及核酸物质解聚。苯酚虽然可以有效的使蛋白质变性，但它不能全部抑制RNA酶的活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（即RNA酶）。存放在Trizol 中的样品可以在负八十保存半年左右。

二、样本材料及其处理方法：

贴壁培养细胞

1.吸出培养液，细胞用预冷的1×PBS清洗两次。2. 吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培养细胞中加入1 ml的Trizol，轻摇培养皿，确保溶液均匀分布于细胞表面。（可用细胞刮刀剥离细胞）

2.吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培养细胞中加入1 ml的Trizol，轻摇培养皿，确保溶液均匀分布于细胞表面。（可用细胞刮刀剥离细胞）

3. 使用移液器反复吹打使细胞脱落，然后将内含细胞的裂解液转移至离心管中，再用移液器吹打直至裂解液中无明显沉淀（溶液清亮）。

4. 室温静置5-10分钟后，再进行后续的RNA提取操作。

悬浮培养细胞

1. 将悬浮细胞收集至离心管中，12000 rpm 4℃离心2分钟，弃上清，用预冷的1×PBS清洗两次。

2. 向1×106-2×107细胞中加入1ml的Trizol。

3. 用移液器吹打至裂解液清亮无明显沉淀。

4. 室温静置5-10分钟后，再进行后续的RNA提取操作。

动物组织、植物材料样品

1. 将准确称取的RNA提取样品转移液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织（研磨过程中需要不断向研钵中补加液氮），直至研磨成粉末状，然后向粉末中加入适量的Trizol并混匀。（针对柔软易裂解的组织样本，可以使用匀浆器加入适量Trizol进行匀浆裂解。）

2. 将上述混合液转移至离心管中，用移液器反复吹打充分混匀。室温静置5分钟，12,000 rpm 4℃离心5-10分钟。

3. 小心吸取上清液，移入新的离心管中，再进行后续的RNA提取操作。

三、操作步骤：

（1）样本前处理。

（2）向上述裂解液中加入Trizol体积量1/5氯仿，充分混合（涡旋或用枪头混匀）。室温静置15分钟。

（3）12000 rpm 4℃离心15分钟。小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：上清液（含RNA）、中间蛋白层及下层有机相。吸取上清液转移至另新的离心管中。

注：每管大概取 200-300 μl，此步骤非常关键，提出的RNA质量好纯度高即可。若吸取水相时吸到有机相会导致双峰，A260/230特别低。

（4）沉淀 RNA：向其中加入相同体积异丙醇，上下颠倒混匀。在-20℃放置10 min。12000 rpm 4℃离心10 min后弃去上清。

（5）清洗 RNA：向沉淀中加入500 μl 预冷的无水乙醇，吹散沉淀洗涤RNA，洗涤两次，12000 rpm 4℃离心后弃去上清。

注：把沉淀弹起来，让其悬浮在酒精中，然后放1-2min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。

（6）打开离心管，室温干燥沉淀约5分钟。

注：不要离心干燥，否则RNA将很难溶解，如果残留乙醇较多可延长干燥时间。

（7）向离心管中加入20 μl DPEC水溶解RNA。将溶解后的RNA放入-80℃保存。

注：如果提取的是组织样本，溶解液可以多加点。

（8）取2 μl进行电泳。

四、注意事项：

1. 防止RNA酶污染。

• 戴好口罩，手套。
• 全程最好在生物安全柜操作（根据实验条件）
• 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。耗材均需要通过DPEC处理。

2. 明确目标。

• 提取成功标准是RNA的质量和纯度，而不是得率。

3. 测量结果：

• A260/A280：1.8-2.2，若<1.8则表明有蛋白质污染；

• A260/A230：1.5-2.4，若<1.5则表明有明显的有机物如糖、肤、苯酚的污染。

安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。

可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商，公司出资存备了大量现货，配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持，随时为客户提供服务。