琼脂糖凝胶电泳实验

一、琼脂糖凝胶的特点

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。

（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

（2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微， 因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

二、DNA 的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。

1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

（1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。

（2）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖浓度与DNA分离范围：

2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型 DNA 的移动速度次序为：供价闭环 DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线 DNA>开环 的双链环状 DNA。

当琼脂糖浓度太高时，环状 DNA不能进入胶中，相对迁移率为 0（Rm=0），而同等大小的直线双链 DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

三、琼脂糖凝胶电泳实验方法

1、选择适合样品预期片段大小的琼脂糖凝胶浓度百分比。将琼脂糖粉末与用于运行凝胶的相同类型的缓冲液（TAE）结合起来，加热使混合物融化，避免沸腾。

2、选择所需尺寸的凝胶浇注模具和梳子，为样品和marker提供足够数量的孔，以及容纳每个待装样品数量的孔容量。

3、胶凝固后，将凝胶放入电泳仪中，电泳液没过凝胶，根据加入量的多少，决定混合多少ul的loding buffer，将样液混合loding buffer用移液枪加入到凝胶中。

4、盖上盖子，确保电极和盖子的方向正确，注意正负极， 打开电泳仪 ，设定凝胶运行的时间和电压，根据样品大小确定运行时间。

四、琼脂糖凝胶电泳实验技巧和注意事项

1、琼脂糖凝胶溶液配制时总液体量不宜超过锥型瓶50%容量。

2、加热时可以中途摇动摇动，防止琼脂糖凝胶凝在锥形瓶底部。

3、注意不要损伤梳底部的凝胶。防止加样时样品漏出。

4、凝胶浓度越低，分辨的片段越大；凝胶浓度越高，分辨的片段越小。

5、使用紫外透射仪观察，紫外光对DNA 分子有损伤作用，不可长时间照射。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间以减少紫外光切割DNA。

6、紫光灯下观察时应戴上防护镜，以免损伤眼睛。

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