人血浆IgG分离、纯化实验

一、实验原理

IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，也是动物和人体血浆的重要成分。血浆蛋白质成分多而复杂，要从血浆中分离出IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用广泛。DEAE-纤维素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纤维素上引入二乙基氨基乙基，属于弱碱型阴离子交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7～9，pH超过9.5，DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解离基团，与蛋白质的交换量可75-122mg/100mgDEAE。应用离子交换剂来纯化物质，是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上，然后再分别洗脱下来获得纯品，或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上，需要的成分直接流出，得到纯品。

本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG，利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG，此时IgG粗物中除IgG外，其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷，可以和DEAE上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电，而不发生交换吸附，利用此特点，让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱，即可直接收集到较纯的IgG。

二、实验方法和步骤

1.取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

2.3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3.在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min。

4.3000r/min离心20min，弃上清。

5.于沉淀中加20 ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30 min。

6.3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。用10 ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

7.透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24 h，中间换液数次。

8.以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 （取3~4 ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

9.离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

10.过DEAE－纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。

三、注意事项

1.一般不选用去离子水作为透析液，因为当选用去离子水时，透析袋内外达到渗透平衡时，因透析袋内蛋白质浓度很高，集聚了大量的负电荷，会产生很大的渗透压。通常选用低浓度的缓冲液作为渗透压。

2.透析袋在出厂时，一般使用10%甘油处理过，因此可能含有极微量的重金属，硫化物等对蛋白质有害的杂志。使用前可将透析袋建成10~20cm每段，在2%的碳酸氢钠和1mmol/L的EDTA混合液中煮沸10min，并用蒸馏水全部洗净，存放于4℃，使用前需先灌满水，指压检查不漏，方可装样，留有三分之一至一半的空间，以防透析袋涨破。

3.透析过程中每隔2小时换一次透析液，共操作3次后，第四次更换透析液，保持过夜，第二天早上即可得到纯化样品。

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