24条细胞培养经验

什么是细胞培养？

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。

不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个非常重要的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术中十分重要的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。

细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

细胞培养总会遇到细胞污染、胞质疏松，状态不好，养不起来等等问题。接下来就给你们介绍一些常见问题解决方法。

细胞培养的菜鸟问题集

1.冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？

除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入10-15ml新鲜培养基，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞可能无法立即适应，导致细胞状态不好甚至死亡。

4. 可否使用与原先培养条件不同的血清？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5. 培养细胞时应使用多少浓度的CO2？5%还是10%，或根本没有影响？

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2 培养细胞。

6. 何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

7. 培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素，但实际操作中有时会加入1%的青链霉素来避免细菌污染。

8. 贴壁细胞继代时该使用多少浓度的trypsin-EDTA？

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一般使用浓度为0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

9. 悬浮细胞应如何继代处理？

一般仅需在原培养瓶中持续加入新鲜培养基，稀释细胞浓度即可，若培养液太多，可将培养瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的培养瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

10. 一般动物细胞的离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为300 g (约1,000 rpm)，5-10分钟，过高转速将造成细胞死亡。

11. 合适的细胞接种密度是多少？

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦可能会导致细胞生长过慢。

12. 细胞冷冻培养基的成份是哪些？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C预冷。

13. DMSO的等级和无菌过滤方式？

冷冻保存使用的DMSO等级必须为Tissue culture grade，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，避光保存。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO的Nylon材质滤膜。

14. 细胞冻存的步骤是什么？

冻存方法一：冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冻存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 °C至–80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，但存活率会降低。

15. 冻存时细胞密度为多少比较合适？

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106cells/ml vial为宜。

16. 应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。造成细胞污染的主要原因有无菌操作技术不当、操作室环境不佳、实验耗材污染、血清污染和细胞来源污染等。严格的无菌操作技术、清洁的环境和品质良好的细胞来源是避免污染的最好方法。

17. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接灭菌后丢弃之。

18. 支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响细胞所有的生长参数。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果方有意义。

19. 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？

直接灭菌后丢弃是最佳的方法，以避免污染其它细胞株。但如果样品比较珍贵，可以购买市面上现有的支原体去除试剂，尝试拯救一下。

20. CO2培养箱的水盘如何保持清洁？

定期更换无菌蒸馏水或无菌去离子水(至少每两周一次)。

21. 为何培养基保存于4 °C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？

培养基保存在4 °C冰箱中， 培养基内的CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。

22. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？

不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，但对大部分细胞没有太大之影响，只有少数细胞可能会因使用不同厂牌的dish或flask而表现出生长差异。

23. 购买的细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少的情形？

研究人员在解冻细胞后出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

24. 购买的细胞出现死亡率高或状态不佳的可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C太久。

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