一、介绍

小鼠精原细胞（GC-1 spg）为贴壁细胞，细胞形态呈上皮细胞样。

二、主要耗材、仪器及试剂

15ml离心管、50ml离心管、冻存管、巴氏滴管、培养瓶、封口膜、CO2培养箱、离心机、显微镜、生物安全柜、DMEM、胎牛血清（FBS）、PBS缓冲液、青-链霉素（双抗）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）等等。

三、培养流程

1. 细胞复苏

1)擦拭生物安全柜台面，准备好所需耗材，紫外30min，打开37℃恒温水浴箱预热所用试剂；

2)按照DMEM＋10% FBS＋1% P/S的比例配制血清培养基，吹打混匀后按10倍细胞的体积分装至15ml离心管中；

3)从液氮中取出GC-1 spg细胞，在水浴箱中快速晃动使其融化；

4)将细胞悬液转移至提前分装有血清培养基的离心管中，吹打混匀；

5)1200rpm，离心3min；

6)弃去废液，向离心管中重新加入新的培养基，重悬GC-1 spg细胞沉淀，并转移至培养瓶中进行培养。

2. 细胞传代

1)细胞密度超过80%即可进行传代，拿出细胞，弃去旧培养液；

2)用PBS冲洗细胞2-3次（动作要轻柔，清洗时可摇晃培养瓶以保证清洗效果）；

3)弃去废液，向培养瓶中加入事先预热好的胰蛋白酶（用量要足以覆盖细胞层），轻轻晃动培养瓶以利于消化；

4)1min左右后在显微镜下观察细胞，当90%细胞被消化下来时，向培养瓶中加入2-3ml的血清培养基，终止消化；

5)收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm，离心3min；

6)等待离心过程中，可提前在新的培养瓶中加好完培（如T25培养瓶可先加4ml完培）；

7)弃去废液，用2ml的完培重悬细胞后分装至新的培养瓶中；

8)盖上培养瓶盖子，以划“十字"的方式晃动培养瓶，以使细胞分布均匀，置于37℃，5%-10%CO2培养箱中进行培养。

3. 细胞冻存

1)从培养箱中取出培养瓶，弃去旧的培养液，用PBS清洗2-3次；

2)加入预热的胰蛋白酶消化细胞，镜下观察消化后加入2-3ml完培终止消化；

3)收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm，离心3min；

4)等待离心过程中，按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制冻存液；

5)离心结束后，弃去上清，向离心管中加入冻存液，重悬细胞，分装至冻存管中；

6)将冻存管放入程序降温盒中（“慢冻"），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出细胞置于液氮罐中保存。

四、注意事项

1．培养细胞所用的培养基及血清等试剂最好沿用之前的，切忌频繁更换；

2．弃去旧的培养液时最好不要直接倒掉，以免瓶口有残留造成污染；

3．用胰酶消化细胞时，可轻轻晃动培养瓶，并在显微镜下观察，细胞间隙变大，轻晃培养瓶细胞可自然流下时即可终止消化，切忌剧烈拍打培养瓶；

4．对于难消化的细胞可以分两次进行消化，以防胰酶消化时间过长对细胞造成损伤；

5．一定要分清细胞培养瓶的正反面。

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