小鼠脾脏native CD4+ T细胞的分离和原代培养

在生物医学实验中，细胞培养是基础中的基础，大部分实验只需要用到相关细胞系的培养，但对实验动物原代细胞的培养也是非常重要的。脾脏T细胞的分离和培养就是免疫学领域的一种非常基础和重要实验方法。本文将详细探讨小鼠脾脏T细胞分离培养的关键步骤，帮助大家更有效地进行实验操作。

一、实验目的

提取小鼠脾脏的naive CD4+ T细胞，研究某种因素对naive CD4+ T细胞或某一亚型的CD4+ T细胞增殖分化和功能状态的影响，或者在诱导分化为CD4+ T细胞的某一亚型后做下游实验。

二、实验内容

小鼠脾脏naive CD4+ T细胞的分离和原代培养

三、实验条件

动物房超净台、细胞房超净台

四、实验设计原理和方法

原代细胞的培养实验中，无菌分选是关键。磁珠分选（MACS）和流式分选（FACS）是最经常使用的两种分离特定细胞的方法。

流式分选可以有以下特点：

1.实现单个细胞的分选

2.同时分选多种细胞

3.可以基于细胞表面标志物表达水平进行分选

4.可以基于细胞内标志物进行分选

5.可以分选由多个标志物复杂组合的细胞类型

磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗结合，在外界磁场中与抗体结合的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而缺乏该表面抗原的细胞则不能在分选柱内停留。分为阳性分选（磁珠结合的细胞是目的细胞）和阴性分选（磁珠结合的细胞是非目的细胞）两种分选策略。

与流式分选相比，磁珠分选更简便更快捷，是分离常见细胞类型的第一选择。在样本量较大或分选稀有细胞类型时，先磁珠分选后流式分选的方案能够显著提高分选的效率。

五、实验材料

（一）10cm培养皿、PBS、75%酒精、24孔板、手术器械（两套）

（二）STEMCELL磁珠分选仪器、磁珠分选磁力架、分选柱、70um细胞滤网、裂红液

六、实验步骤

（一）取脾（动物房超净台）

1.将小鼠脱颈处死，用75%酒精浸泡一分钟后放入10cm培养皿中准备解剖，使用不同的小鼠品系可能会影响产量和性能。例如，来自C57BL/6小鼠的细胞更好地产生Th1细胞，而来自Balb.c小鼠的细胞更好地产生Th2细胞。；

2.第一套器械用于剪开分离皮肤肌肉，暴露出足够的视野时，换用第二套器械用于取脾。之后处理每一只小鼠时，第一套和第二套器械都不要混用；

3.取出的脾放入装着PBS的24孔板中。

（二）制备单细胞悬液（细胞房超净台）

1.将脾脏放在70um细胞滤网上，研磨并加入5ml PBS（一个脾脏用5ml）过滤，过滤至15ml/50ml离心管中，这一步建议过滤两次，否则会在后续离心时形成富含纤维的沉淀，弃置此沉淀又会浪费很多细胞；

2.600g离心5min，弃上清。每个脾脏5ml/10ml裂红液重悬，室温裂红5min，加入2ml/4ml PBS（与裂红液体积对应）终止；

3.600g离心5min，弃上清。每管脾脏取1-2ml PBS重悬，从中取出100ul依次稀释成10倍和100倍；

4.从10倍和100倍稀释液中取出10ul放入细胞计数板，进行计数。

（三）磁珠阳性分选（细胞房超净台）

磁珠分选大致分为三个步骤：润洗（用分选buffer润洗分选柱）、过滤（多次重复过滤细胞悬液）、洗涤（用分选buffer洗涤柱子，使细胞洗脱）。

（四）T细胞分化培养基制备（细胞房超净台）

1.磁珠分选前一天（也就是Day0）准备培养板，加入250ul anti-mouse CD3（2 µg/mL或3 µg/mL，用PBS稀释），37℃孵育2小时或4℃过夜包被。

2.配置T细胞基础培养基（50ml）：48.5ml的1640（血清）细胞培养基、0.5ml HEPES、0.5ml GlutaMAX、0.5ml丙酮酸钠、50ul 2-ME；

3.重悬分装各类细胞因子，最终浓度为10ug/ml，于-20℃保存；

4.配置各种分化培养基（用24孔板进行分化培养，每个孔加入1ml培养基）

（1）Th1：10ml基础T细胞培养基，加入10ul IL-2，10ul IL-12，10.3ul IL-4抗体；

（2）Th2：10ml基础T细胞培养基，加入10ul IL-2，10ul IL-4，11.5ul IFN抗体；

（3）Treg：10ml基础T细胞培养基，加入10ul IL-2，10ul TGF-β；

（4）Th17：10ml基础T细胞培养基，加入10ul IL-2，2ul TGF-β，20ul IL-6，10ul IL-1β，10.3ul IL-4抗体，11.5ul IFN抗体；

（以上培养基在4℃仅能保存一周）

5.每1ml细胞悬液（10^6个细胞）加入25ul CD3/CD28磁珠，振荡混匀。不论任何分化体系都需要有CD3/CD28/IL-2的参与，这3者是T细胞增殖的基本功能抗体和细胞因子；

6.将分选出的naive CD4+ T细胞离心，按照你想要研究的亚型分成不同部分，用各自的分化培养基重悬，以10^6个细胞/1ml加到24孔板中培养

7.Day2.3 仅观察；Day 4 直接在原孔中补充分化培养基；Day5 仅观察；Day6 收取细胞，通过流式检测分泌的细胞因子的水平，进行后续实验。

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