细胞冻存的实验步骤＆注意事项

细胞冻存实验用于保护细胞免受损伤，以便在需要的时候重新复苏和使用，对于保存少有的细胞资源、制备细胞库、研究细胞生物学等方面具有重要意义。

实验步骤：

1.细胞冻存液提前配置：冻存液配置比例根据实验习惯即可，若细胞不多或使用人数较少，建议一次少量配置，配置完成后，由于DMSO的存在，因此需要严格避光保存。

2.需要冻存的细胞密度要求≥90%，镜下观察细胞，当细胞密度满足要求后，弃掉原有培养基，沿培养皿边缘加入1ml温浴的PBS缓冲液清洗。

3.弃掉PBS缓冲液，加入胰酶消化细胞，消化时间根据细胞类型决定。

4.消化到时间后，加入二倍胰酶体积的培养基终止消化，用移液器将细胞全部吹下，转移至离心管内。

5.离心机常温800rpm，离心5min。

6.弃上清，加入1ml配置好的冻存液，用移液器轻轻吹打10-15次混匀。

7.冻存管标记好相应信息，包括细胞名称、代数、冻存时间、操作者姓名等，将上述混悬液全部转移至冻存管内，拧紧冻存管管口，放入程序降温盒内。

8.将程序降温盒放入-80℃冰箱内，36h后可从程序降温盒内拿出细胞放在细胞冻存架上保存。

常见问题

1.细胞冻存管具体存放方式、温度、时间等由实验室条件决定，我所述只是我实验过程中冻存细胞的保存方法。

2.关于冻存液的配置，我实验所用配方为培养基：血清：DMSO =7：2：1，整个实验过程中冻存的细胞复苏状态良好。

注意事项

1.在冻存管上标记信息时使用一支质量较好的马克笔，保证在后期进行细胞复苏时信息不会被水或酒精洗掉。

2.细胞冻存时应保证细胞状良好，无污染。

3.细胞冻存原则为“慢冻"，因此，细胞加入冻存管后如何保存应严格遵守冻存流程，避免冻存太快，产生结晶。

4.二甲基亚砜（DMSO）是一种细胞保护剂，在深低温情况下可防止细胞内形成冰晶，减少细胞损伤，因此冻存液配置中DMSO是不能少的，但可以改变血清的比例，对于一些原代细胞或较为重要的细胞，可将血清比例提高至50%-90%，保证其有较高的存活率。

5.细胞冻存后再进行复苏时，细胞数量不可避免会减少，因此，在冻存前，细胞量要足够多，密度≥90%。

6.细胞混悬液加入冻存管后，不宜在常温放置过久，因此应先将细胞冻存盒放入冰箱，再进行后续相关实验。

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