要做好CCK-8实验，这三个重要环节请注意

在做细胞基础实验时，必要的一步就是需要探究清楚细胞的增殖变化和毒性耐药变化情况，为下一步实验做准备。

我们在做CCK-8增殖和毒性实验中常常会遇到一下几个问题：

1.细胞铺板问题 2.给CCK-8的方式问题 3.CCK-8的反应时间问题

首先，在进行细胞铺板时， 需要用血球计数板进行细胞计数，得到细胞数量后按照所需铺板的细胞数量进行调整。一般96孔板铺板数量为1*10^6/孔。

制备细胞悬液时需要反复吹打，使细胞悬液充分混匀，降低出现细胞团块的几率。一般96孔板，每孔加入100微升细胞悬液，从孔的9点钟方向打入，加入半张板子时，需要再次将细胞吹匀，然后继续加剩余的孔。

待全部加入完毕时，盖上盖子，放入培养箱。（细胞的均匀铺被是本实验成功的大前提）。

其次，是细胞的处理。一般给CCK-8有两种方式：第一种是直接每孔加入10微升的CCK8原液；另一种则是配置含10%的CCK-8培养基，以换液的形式加入孔板。

第一种方式的弊端在于10微升的CCK-8量比较少，可能因沾在孔壁导致误差的出现。

第二种方式可以避免上述情况的发生，但操作过程中仍需注意10%的CCK-8培养基需要现配现用；其次打入100微升的CCK-8时沿着孔壁将枪头伸入液体缓缓打出，再移出枪头。

期间可能会产生小气泡，需要用无菌针头烧红插入气泡，消除气泡。（气泡会影响OD值，因此应该尽量消除）。

最后，就是反应时间问题。将孔板放入培养箱培养1-4小时，引细胞种类和数量的差异，可能形成的Formazan的量不一样。因此需要把握好培养的时间。

我的经验是：在培养2h后，取出孔板，每孔抽取90微升加入至新孔板，进行第一次检测，看看显色的深浅程度（仍然需要注意气泡，若有气泡需要待气泡消除后再进行检测）

若显色较浅，则可除去旧培养基，加入新培养基，再培养1-4小时，重新加CCK-8步骤，然后将其放入培养箱培养4小时，再进行检测（其最佳反应时间为0.5、1、2小时）

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