如何提高DNA浓度/纯度测定的准确性？

分子生物学实验中经常需要对样品进行浓度和纯度的测定，它相当于一种质控，以此来确保下游实验的结果可靠。

常用的DNA浓度/纯度测定设备是紫外分光光度计，它的原理是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射吸收来进行分析物质成分。

这样来描述可能有点生硬，我们举个栗子：

假设现在有一样物质A，它溶解在溶液内，当光照射溶液时，溶液内的A会吸收一部分的光。不同颜色的光有不同的波长，A对不同颜色的光（不同波长）的吸收程度是不一样的。

双链的DNA，它能对波长为260nm的光进行强烈的吸收，吸收的程度可以用一个叫吸光度的数值来测量，浓度越高的DNA，理论上吸光度也越高。

最后，通过与标准品的吸光度数值对比后，就可以知道未知浓度的DNA有多少量了。

DNA浓度测定通常会使用紫外分光光度计，常见的有NanoDrop这类设备。除了DNA，它还能测定RNA和蛋白的吸光度。

要提高浓度测定的准确性，需要注意以下几点：

• 检测之前，务必充分混匀DNA溶液，因为这类机器的上样检测体积只需要1-2uL，如果样品没有混匀，那么每次检测样品浓度也会不一样。

• 因为上样体积很小，所以样品很容易挥发，如果把样品加在检测基座后不马上检测的话，会导致测出来的样品浓度偏高。

• 实验环境和耗材的稳定性要高。检测设备应该在放置在温度可控、通风的环境下；装样品的管子如果不是要进行吸取样品操作的话，需要时刻紧闭。

• 每次检测完毕，都需要对检测基座或者比色皿进行清洗和擦拭，确保不会有样品残留后，再进行下一次上样检测。

• 空白调零，应该使用溶解待检测样品的溶液来调零。例如如果用水溶解DNA，那就用水调零，用其他缓冲液溶解，则用对应的缓冲液调零。

在测定后，我们通常会看到，设备会提供几个不同的结果给我们，有的是数值，例如OD230、OD260，有的是比值，例如OD260:280，那这些结果代表什么呢？

OD是optical density(光密度)的缩写,表示被检测物吸收的光密度。

OD=lg(1/trans)，其中trans为被测物质的透光值。

不同的OD以及OD比值，代表不同的意义：

【OD230】

提取核酸时会用到各种化合物，它们以盐离子的形式存在，例如胍盐、苯氧基离子、硫氰酸酯。

这些盐离子对230nm波长的紫外光有强烈的吸收值。如果测定核酸时，发现OD230数值很高，代表溶液中的盐离子浓度很高。

【OD260】

双链DNA在这个波长下会对光有强烈的吸收。

【OD280】

芳香族氨基酸在这个波长下，有强烈的光吸收。如果该数值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白质的污染.

【OD320】

通常是由光散射造成的。如果该数值很高，意味着溶液内有颗粒物污染、待检器皿例如比色皿有污渍。

【OD260:OD280】

通常用于判断DNA或RNA溶液的纯度。常用的指标是：在OD230数值较低，OD320数值较低的前提下。较高纯度的DNA，比值应该为1.7～1.9之间，较高纯度的RNA，比值应该为1.9～2.0之间。

当然，以上测定的结果并非是绝对计数的数值，它是一个参考数值，因为我们在测定时是不涉及用到标准品这样东西，所以，也就是我们测出来的数可以作为一定程度的参考。

而且，当一些外界因素影响时，测定也会出现偏差，例如样本含量非常非常低时，测定的数值误差就会很高并不具参考意义，设备耗材出现问题时，测定的数值也会不准。

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