Lipofectamine ™ RNAiMAX转染

转染是实验过程中常用的技术操作，通俗来说，常见的转染即为把某种功能性质粒转到细胞中去，通过转染试剂的作用在经过一段时间后，收集细胞通过WB、qpcr等来检测质粒是否正常发挥作用来达到我们实验的某种需求；不同的质粒通常有不同的转染试剂和不同的方法，如PEI转染、lipo2000转染等。

Lipofectmine ™ RNAiMAX转染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 双链体转染使用，具有转染效率高、对细胞毒性小等优点，分为正向转染及反向转染两种方式。siRNA转染比较常见，因此本文分享主要针对siRNA反向转染。

转染前准备

1.准备试剂包括：Opti-MEM培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX试剂、siRNA、不加双抗的10%FBS培养基、胰酶、PBS缓冲液等常见处理细胞的试剂。

2.反向转染要求细胞密度≥90%。

转染中

1.按正常处理细胞的流程将长满的细胞经过胰酶消化离心后去上清，注意此处需要加无双抗的10%FBS培养基1ml进行细胞重悬，重悬完后根据细胞生长速度铺细胞，保证转染完后24h细胞密度达到30-50%。

2.转染复合物制备：根据说明书制备转染复合物，添加量如下表所示。

根据转染的实际情况将Opti-MEM培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX试剂、siRNA依次加入到一个无菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培养基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX试剂的顺序，轻轻混匀室温孵育20min。

3.20min后依次将转染复合物加入细胞培养皿种，轻轻混匀，放入细胞培养箱内。

转染后

1.转染后24h内最好不要挪动细胞，也不要拿出在显微镜下观察，期间也无需进行细胞换液。

2.转染后48h后，可拿出细胞观察细胞形态有无变圆，肉眼观察转染效率，对于生长较慢的细胞，其表型可能会在72h内逐渐显现。根据细胞生长情况可进行换液，注意此时需要换含双抗的血清培养基。

3.在显微镜下观察细胞形态，若细胞变圆较为厉害，应在转染后4天左右收细胞进行转染效率测定，时间太久细胞太少的话检测难度较大。

4.此种转染方式最长可维持5-7天的基因敲除效果。

注意事项

1. Lipofectamine™ RNAiMAX试剂在冰箱4℃保存，切记不能冷冻。

2. Lipofectamine™ RNAiMAX试剂不宜在室温放置过久，因此在制备转染复合物前从冰箱拿出，加完后应立即放回4℃再进行后续操作。

3.转染复合物制备完成后室温孵育时间不得超过20min，因此建议将细胞铺好板后十字混匀，暂放于细胞培养箱内，再进行转染复合物的制备。

4.siRNA应于-80℃保存。

5.在处理细胞重悬时一定要使用无双抗的10%FBS培养基，避免细胞死亡，如果在铺板后还要进行细胞传代也没有影响，直接用上述混悬液传代即可。

6. Lipofectamine ™ RNAiMAX转染的两种方式差别不是很大，主要区别在于正向转染需要提前一天进行细胞铺板，第二天直接加入转染复合物，同时还需要在转染后4-6h进行细胞换液。反向转染速度比正向转染更快，操作较为简洁，因此更建议使用反向转染。

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