原位杂交实验流程

原位杂交组织（或细胞）化学简称原位杂交，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。

一、合成RNA探针

1、设计探针引物

RNA探针长度500bp最为合适。一轮引物不添加启动子序列，二轮引物在正向引物的5端加上T7启动子序列，在反向引物的5端加上SP6启动子序列。

2、探针合成

用未添加启动子序列的引物克隆出探针序列的DNA模板，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。胶回收，将其连接到T载体上，转化涂板，进行质粒提取送测。用添加了T7和SP6启动子序列的引物再次给探针序列两端添加上启动子序列。取一轮以质粒为模板扩增PCR产物进行琼脂糖进行PCR扩增，凝胶电泳验证，若条带单一明亮，胶回收PCR产物用于后续体外转录。

3、体外转录

利用PCR扩增出的带有启动子序列探针的DNA模板，分别用相应的RNA聚合酶进行体外转录，得到单链RNA探针。探针包括正义探针和反义探针，用正义探针(T7RNA 聚合酶转录得到)进行的原位杂交实验作为阴性对照组，用反义探针(SP6RNA聚合酶转录得到)进行的原位杂交实验为实验组。体外转录体系如下:

混匀后37，孵育2小时。

4.质量检测、中止消化

转录结束后，取1ul转录产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳条带明亮不弥散则进行下一步。验证后，每管加入2DNase，37消化15min，去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)终止消化反应。

5.沉降洗涤保存

每管用DEPC水补至100uL，加入2倍体积的的无水乙醇和1/10体积的的3M乙酸钠，置于-80℃沉降过夜/-20℃沉降30分钟。将沉降后的体系放入离心机中，4℃，12000rpm离心15分钟，弃除上清。加入100uL70%无水乙醇浸洗，4℃，12000rpm离心15分钟，弃除上清，在超净台风干。将沉淀的RNA探针加入DEPC水溶解，使其浓度为10ng/uL，分装后放入-80℃保存备用。

注意事项：

（1）DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在各步处理中，所有液体试剂都应经 DEPC 处理。

（2）含有 Tris缓冲液的溶液中，不能加入 DEPC。

（3）原位杂交引物用同一个遗传背景的个体克隆全长测序成功，在测序成功的全长序列上设计引物，保证特异性。

二、杂交

1、准备工作

①圆形细胞爬片在浓盐酸中浸泡过夜，经超纯水冲洗后，浸泡在无水乙醇中；②将圆形细胞爬片、玻璃培养皿、金属镊子180℃高温烘4h去除RNase；③取出后静置1h冷却，培养皿中加入0.1mg/ml多聚赖氨酸处理。④正、反面各避光浸泡15min；⑤ 用镊子依次夹取玻片，迅速蘸取DEPC水，正面朝上放在锡箔纸折起的褶皱上，37℃放置3h备用。

2、组织包埋与切片

原位杂交实验组织石蜡包埋，将包埋好的蜡块从-20℃取出，刀片、台面、切片机等用RNase抑制剂喷雾喷洒擦净，修整好的蜡块固定于切片机上，切片厚度设置为5μm，将蜡带在43℃ DEPC水中水浴展开，用多聚赖氨酸处理过的圆形玻片捞取蜡带，置于锡箔纸褶皱上37℃烘干过夜。

3、脱蜡与复水

镊子夹取圆形玻片依次于下述玻璃培养皿中：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脱蜡→二甲苯：乙醇（1:1） 6min→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度复水。

4、预杂交

①镊子夹取圆形玻片至24孔板中，每孔加入500μl DEPC水洗涤4min；②加500μl PBST（1×PBS+0.1%Tween-20)洗涤10min，洗2次；③加300μl 2μg/ml蛋白酶K，37℃消化12min；④加500μl 0.1M TEA孵育10min；⑤加500μl PBST 10min，洗涤两次；⑥加500μl 4%的多聚甲醛，避光固定20min；⑦加500μl PBST，10min，洗涤两次；⑧加300μl HB杂交液，60℃预杂交4h。

HB杂交液的配制：

HB现用现配，本次实验一次配制3份。

5、探针变性与杂交

将200ng探针加入到30μl HB杂交液中，95℃变性5 min，迅速置于冰上冷却，然后加入到270μl已60℃预热的装有HB杂交液中1.5ml 无酶管中，充分混匀后加入到样品孔中，60℃杂交17h。

6、洗脱探针

洗脱探针所用试剂均需37℃/60℃预热，并在相应环境中洗脱。

洗脱探针条件

7、封闭、抗体孵育

①向样品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗涤10min，洗涤两次。②加入300μl Blocking bufferr（1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20）避光封闭1.5h。③按照1：3000比例将Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗体加入到Blocking buffer中，充分混匀后吸取 300μl 加入样品孔，避光孵育 1h。

8、洗涤抗体

向样品孔加入500μl MaNaT洗涤抗体,避光洗涤5min重复2遍，再加入500μl MaNaT洗涤抗体，避光洗涤15min重复4遍。

9、显色及终止反应

吸出 MaNaT，加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗涤两次，每次5min；按1:50的比例将 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中，充分混匀后吸取 400μl 加入样品孔，避光显色10min，镜检观察到蓝紫色信号时，吸出显色液。

10、复染

吸出 PBST，加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min；吸出固定液，加入 500μl PBST 洗涤两次，每次 10 min；吸出 PBST，加入 300μl 1%中性红染液复染。

11、封片

复染后，用镊子夹取玻片，依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脱水；在 100%无水乙醇：二甲苯(1:1)中处理浸泡2min；在二甲苯中浸泡5 min；最终以中性树胶封片。

12、显微观察

使用 1 至 4 倍放大倍数观察组织杂交整体信号表达情况，使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍数观察局部杂交信号，拍照。

A, B:斑马鱼中某基因正义RNA探针信号分布；

C, D: 斑马鱼中某基因反义RNA探针信号分布。

以上就是本期的内容，更多资讯，欢迎点击安培生物网站链接了解更多技术与产品资讯。

安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。

可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商，公司出资存备了大量现货，配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持，随时为客户提供服务。