ATAC-Seq 实验操作指南---02 ATAC-Seq 基本操作流程

02 ATAC-seq 基本操作流程

本产品适用于哺乳动物细胞的染色质可及性／开放性研究，针对的细胞投入量为100-100,000个。

必须具备的材料

1、ATAC-Seq建库试剂盒

Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #TD711)

2、建库接头

单端96种接头（每个货号对应24种接头）：

TruePrep Index Kit V4 for Illumina (Vazyme #TD204/TD205/TD206/TD207)

双端96种接头：

TruePrep Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)

双端384接头：

TruePrep Index Kit V3 for lllumina (Vazyme #TD203)

3、其他

Qubit 试剂（Vazyme #EQ121）、PCR仪、磁力架、低吸附EP管、PCR管、无水乙醇

注意事项：

6、扩增产物片段分选

推荐使用ATAC DNA Clean Beads对扩增产物进行两步法片段分选，分选方案为0.55x／1.2x。

（1）涡旋振荡混匀ATAC DNA Clean Beads并吸取33 μl（0.55x）至60μl PCR产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

（2）将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后（约5min）小心转移88μl上清（上清体积＝总体积93-5μl）至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠。

（3）涡旋振荡混匀ATAC DNA Clean Beads 并吸取72μl（1.2x）至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

（4）将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后（约5min）小心移除上清。

（5）保持反应管始终置于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。

（6）重复步骤5，总计漂洗两次。

（7）保持反应管始终置于磁力架上，开盖空气干燥约5min。

（8）将反应管从磁力架上取出，加入22 μl Nuclease-free ddH2O洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

（9）将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后（约5min）小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中，-30～-15℃条件下保存。

7、文库质控

1、用Qubit仪器和对应的试剂测文库浓度

2、安捷伦2100检测文库片段分布

测序技术参数推荐

1、测序策略：lllumina平台，MGI平台，PE 150

2、推荐数据量：开放染色质区域的差异鉴定，不低于30M reads／样本

ATAC-seq 技术关键

样本准备

细胞活性

建议细胞活性＞90％，可以使用台盼蓝染色，进行细胞活力检测；实验过程中对细胞的操作应尽量轻柔，以保持细胞的活性。生长状态不佳或死亡的细胞中，蛋白质与DNA结合的状态会发生改变，甚至蛋白脱落，变成裸露的DNA，转座子随机切割可能产生较强的背景噪音，影响实验结果。

细胞投入量与扩增循环数

受样本类型的影响，实验中可兼容的细胞投入量并不是固定的，早期实验建议投入50,000-100,000个细胞。

文库产出只要满足上机需求即可，无需未来获得更高的文库产量而设置过高的扩增循环数，循环数过多会导致过度扩增、偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。

特殊样本流程

特殊样本流程摘要

特殊样本的核提取以及操作流程可参考以下文献

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