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免疫细胞转染后细胞毒性较高是为何？
发布时间： 2023-01-05 点击次数： 1360次免疫细胞转染时先吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗⼀次。更换无血清培养基。准备转染制备液，⽤灭菌后的EP管制备。以六孔板为例，A液-200μl Opti-MEM稀释4μg质粒;B液-200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。加⼊转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成全培养基，继续培养到24-48小时。免疫细胞转染在转染24h后需要观察转染过程对细胞毒性情况，如果毒性较高，可能是以下原因造成的：1.初期细胞接种浓度太低。2.转染复合物加入量过高，因为不同细胞对转染的敏感度不同。3.转染后6小时需更换培养基，一是lipo2000具有一定毒性，二是培养基需要更换成有血清培养基。其次，转染后需要对转染效率进行检测，比如观察转染后细胞荧光情况、qPCR验证或WB检测敲减或者过表达蛋白。4.对于β-gal表达载体：可用β-gal染色试剂盒进行细胞染色并观察细胞。转染效率高的细胞在染色孵育后3-4h即可观察到，转染效率低的细胞则需要更长的孵育时间。5.对于GFP表达载体：荧光显微镜下观察细胞。如果细胞能在显微镜下被观察到，至少需要有104-105拷贝的GFP蛋白表达，表达太弱的细胞无法镜检。GFP表达情况也能使用流式细胞仪进行检测，同时可加入PI进行染色以监测死细胞情况。若是转染后发现转染效率不高，可通过以下两种方法增强转染效率：1.复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少；2.通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。
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